未成熟蚕豆中矿物质含量、氨基酸组成和微观结构的研究

陈友霞,刘珍珍,杨文艺,孔 霄,林 琳,高春燕

(大理大学公共卫生学院,云南大理 671000)

蚕豆(ViciafabaL.)又名罗汉豆、胡豆或佛豆,在豆科作物中占有举足轻重的地位,长期以来一直是发展中国家(主要是亚洲和非洲)的主要粮食作物[1-3]。我国是世界蚕豆种植面积最大的国家,种植地区主要分布于青海、甘肃和云南等省份,常年播种面积达到2500 km2,总产量达35万吨[4]。蚕豆含有丰富的营养成分,含有22.4%～36.0%的蛋白质、57.8%～61.0%的碳水化合物、12.0%的膳食纤维和1.2%～4.0%的脂质[5]。此外,蚕豆是维生素、矿物质和生物活性化合物的良好来源,如酚类化合物,包括生育酚以及三萜酸[6-8]。目前大量的研究关注于成熟或干燥蚕豆的组成和功能活性,对未成熟蚕豆营养成分的研究较少。然而在一些地区,例如智利[5]和中国[9]对新鲜和未成熟蚕豆的食用需求很大。近年来云南省鲜食蚕豆的生产规模发展迅速,年播种面积和总产量均居全国之首,是全国最大的鲜食蚕豆主产区[10]。

表1 火焰原子吸收分光光度计工作条件参数Table 1 Working conditions of flame atomic absorption spectrophotometer

矿物质和氨基酸是人体维持正常生理功能所必需的营养物质,且矿物质和必需氨基酸摄入过量或不足均会影响人体健康[11-14]。食物中氨基酸的种类、含量及各组分所占的比例是评价其蛋白质优良程度的决定性指标[15-17]。已有研究证实,成熟蚕豆种子中矿物质和氨基酸含量极为丰富[18-21],然而关于未成熟蚕豆中的矿物质含量、氨基酸组成以及微观结构的动态变化还未见报道。本研究以大理州农业科学院培育出的高产、抗锈新品种凤豆15号和凤豆18号为原料,对其三个不同食用阶段种皮和胚中的矿物质含量、整粒蛋白的氨基酸组成和胚的微观结构变化进行研究,以期为蚕豆新品种的培育、推广及消费者科学地选购蚕豆提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

两个蚕豆品种 分别为凤豆15号(FD15)和凤豆18号(FD18),于2016年10月19日种植于大理农业科学院蚕豆研究基地(北纬:100°24′,东经:25°45′,海拔2090 m)。FD15的全生育期为166～170 DAS,FD18的全生育期为172～179 DAS,本实验分三个食用阶段S1(138 DAS)、S2(156 DAS)和S3(173 DAS)进行随机采收,其中S3阶段已达到成熟期(DAS:Days after seeding,播种后的天数);钙、镁、钾、铁、锌、锰、铜、铬标准溶液(1000 μg/mL) 国家标准物质研究中心;硝酸、盐酸(优级纯) 西陇科学股份有限公司;氢氧化钠(分析纯) 天津市福晨化学试剂厂;盐酸、柠檬酸钠(分析纯) 天津市风船化学试剂科技有限公司。

Scientz-ND型系列真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;AA-6200火焰原子吸收分光光度计 日本岛津公司;RJM-28-10马弗炉 湖南长沙市华光电炉厂;DK-98-II电炉 天津市泰斯特仪器有限公司;DFY-600摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;RE-3000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;L-8900自动氨基酸分析仪 日本日立公司;扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy,SEM) 荷兰皇家飞利浦电子公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕豆样品的制备 将三个食用阶段的未成熟蚕豆手工去除豆荚并冷冻干燥(-51 ℃,12 h),手工分为整粒种子、种皮和胚三部分,粉碎过60目筛,储存至-20 ℃备用。

1.2.2 矿物质含量的测定 参照Lu等[22]的方法,采用干灰化法消化样品(称取0.5 g蚕豆种皮和胚的冻干粉末,首先在电炉上碳化,然后置于马弗炉中在(500±25) ℃下灰化4 h),然后溶解在10 mL 10%硝酸(V/V)中。最后,采用火焰原子吸收分光光度计测定K、Mg、Ca、Zn、Fe、Cu、Mn和Cr的含量,结果表示为mg/100 g干重。火焰原子吸收分光光度计工作参数见表1。

1.2.3 氨基酸组成分析 根据Gao等[23]的方法,取整粒干燥的蚕豆整粒种子粉末溶解于NaOH(pH10.0)溶液中,室温下振荡提取3 h,12000 r/min离心10 min,取上清液滴加盐酸将其酸化至pH=4沉淀蛋白质,再以12000 r/min离心10 min回收沉淀的蛋白质,并冷冻干燥(-51 ℃,12 h)。随后,精密称取100 mg冷冻干燥所得的蛋白提取物在氮气下于110 ℃用10 mL 6 mol/L HCl水解22 h,然后用旋转蒸发器(50 ℃,200 r/min)浓缩水解产物,再用柠檬酸钠缓冲液(0.02 mol/L,pH2.2)溶解并定容至5 mL。最后,将所得样品通过0.22 μm聚四氟乙烯微孔滤膜(PTFE)过滤,并采用氨基酸分析仪测定除色氨酸外的17种氨基酸含量,即天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)。

1.2.4 电子显微镜扫描 将干燥的蚕豆胚颗粒均匀分布在粘有导电双面胶的铜柱上,然后固定在载物台上,在低真空模式,20.0 kV、50 Pa的条件下对其微观结构进行扫描电镜(1000×)观察。

1.3 数据处理

表2 不同食用阶段蚕豆种皮、胚中的矿物质含量(mg/100 g DW)Table 2 Mineral content in seed coat and embryo of broad bean in different edible stages(mg/100 g DW)

注:ND代表没有检测到;同列不同小写字母表示相同蚕豆品种不同食用阶段差异显著(P<0.05);同列不同大写字母表示相同食用阶段不同蚕豆品种间差异显著(P<0.05);表3同。

2 结果与分析

2.1 不同食用阶段蚕豆的矿物质含量

两个品种三个食用阶段的未成熟蚕豆种皮和胚中矿物质含量的测定结果见表2。结果表明,种皮中含量最高的矿物质是K(490.23～873.01 mg/100 g DW),其次是Mg(45.43～58.21 mg/100 g DW)、Ca(16.11～81.09 mg/100 g DW)、Zn(3.83～7.59 mg/100 g DW)、Cu(0.76～2.91 mg/100 g DW)、Mn(0.73～1.24 mg/100 g DW)和Fe(0.00～1.58 mg/100 g DW);胚中含量最高的是K(525.86～760.84 mg/100 g DW),其次是Mg(34.71～43.88 mg/100 g DW)、Ca(2.39～26.12 mg/100 g DW)、Zn(4.26～5.45 mg/100 g DW)、Fe(1.87～3.78 mg/100 g DW)、Cu(0.84～1.46 mg/100 g DW)和Mn(0.47～0.87 mg/100 g DW);且Cr在所有蚕豆样品中均未检出。由此可见,两个品种三个食用阶段的未成熟蚕豆种皮和胚中的主要矿物质均为K、Mg、Ca、Zn,且大部分能检测到少量的Fe、Cu和Mn。

各矿物质元素在种皮和胚中的分布呈现多样性。例如,Mg的含量在两个品种的S1～S3阶段均表现为种皮高于胚,而Fe正好相反;K和Cu的含量在两个品种的S1～S2阶段均表现为种皮高于胚,而在S3阶段的含量表现为种皮低于胚。Ca、Zn和Mn的含量在FD18中的S1～S3阶段均表现为种皮高于胚;而在FD15中Ca含量在其S1阶段表现为种皮低于胚,在S2～S3阶段种皮含量高于胚;Zn和Mn在FD15中S1～S2阶段为种皮含量高于胚,而在S3阶段相反。

不同矿物质元素在整个食用过程中的变化不同。例如,随着食用阶段的延后,K含量在两个品种的种皮和胚中均呈现明显下降趋势;Ca在两个品种的种皮中含量均逐渐增加,而在胚中的含量均逐渐降低;与Ca相反,Cu在两个品种的种皮中含量逐渐降低,而在胚中的含量逐渐升高;Mn在两个品种的种皮中含量无显著变化(P>0.05),而在胚中的含量均逐渐升高。随着食用阶段的延后,不同品种的矿物质含量也存在差异,Mg在FD15种皮中的含量随食用阶段的延后逐渐降低,在胚中的含量呈先降低后升高的显著变化趋势(P<0.05),然而在FD18种皮和胚中的含量均无显著变化。

实验结果表明,蚕豆种皮和胚中的矿物质含量均十分丰富,各矿物质的含量与未成熟蚕豆的品种、部位和食用阶段有关,这与柏方敏、刘建明、申小云等[24-26]的研究结果一致,即植物体内的矿物质含量受土壤中各化学元素的组成、含量水平及植物富集能力、植物品种等因素的影响。因此,蚕豆种皮中也含有丰富的矿物质,在食用过程中不要轻易舍弃种皮;此外,随食用阶段的延后矿物质含量变化较大,消费者应根据食用需求合理地选购蚕豆。

2.2 不同食用阶段蚕豆的氨基酸组成

不同食用阶段蚕豆蛋白氨基酸组成见表3。由表3可知,除Cys未检测到外,其余16种氨基酸均检测到。总氨基酸(TAA)含量范围为20.71～85.44 g/100 g蛋白质,总的必需氨基酸(EAA)含量范围为2.65～27.86 g/100 g蛋白质,非必需氨基酸(NEAA)含量范围为18.06～57.58 g/100 g蛋白质。含量最为丰富的氨基酸是Glu、Asp、Arg和Leu,必需氨基酸除了Leu外,Lys、Ile、Phe和Val含量也较为丰富,这与Vioque等[1]的发现一致。

表3 不同食用阶段蚕豆蛋白的氨基酸组成(g/100 g蛋白质)Table 3 Amino acid composition of broad bean protein in different edible stages(g/100 g protein)

注:a代表必需氨基酸;TAA代表总氨基酸。

TAA含量在两个品种的S1～S3阶段均显著增加(P<0.05),EAA和大部分单个氨基酸含量与TAA含量变化趋势一致。TAA和部分EAA(Leu、Ile、Val和Met)含量在三个食用阶段中均表现为FD18>FD15。此外,两个品种三个食用阶段的EAA/TAA范围为12.80%～37.35%,且两个品种的EAA占比均为S2阶段最高。氨基酸评分结果显示,Met在两个品种的各食用阶段中氨基酸评分(AAS)均最低(8.9～18.6),且Cys在所有蚕豆样品中均未检出,这与先前的相关报道[27-28]一致,即大多数豆科种子缺乏含硫氨基酸。不同品种及各食用阶段蚕豆蛋白氨基酸含量的差异及变化可归因于氨基酸通透酶家族(AAP)、植物根际微生物、土壤质地和外界环境等因素的影响所致[29-30]。

氨基酸与矿物质之间的相关性分析结果显示,FD15中Mg和Ile、Leu、Tyr、Lys具有显著的负相关性(r=-0.999,P<0.05;r=-0.998,P<0.05;r=-0.999,P<0.05;r=-1.000,P<0.05),Fe与Glu也具有显著的负相关性(r=-0.999,P<0.05)。FD18中Zn和Gly、Val之间具有显著的正相关性(r=0.999,P<0.05;r=0.999,P<0.05),K和Pro具有显著的负相关性(r=-1.000,P<0.05),其他矿物质与氨基酸之间均无相关性。这说明蚕豆在成熟过程中对矿物质的吸收、富集与氨基酸的合成之间没有明显的相互作用。

2.3 不同食用阶段蚕豆的显微结构

为了研究不同食用阶蚕豆胚的微观结构变化,采用扫描电子显微镜对其微观结构进行了观察,结果见图1。图1中观察到的从卵形到球形不同形状的颗粒是淀粉颗粒。附着在淀粉颗粒上的非均匀不规则的颗粒,它们代表蛋白质体或蛋白质基质、矿物质和纤维成分的碎片,这与Ma等[31-32]在不同豆科植物中所报道的一致。众所周知,豆科植物种子在成熟过程中淀粉含量不断增加[33]。从图1中可以看出,蚕豆淀粉颗粒的大小随食用阶段的延后逐渐增加,这表明蚕豆胚中淀粉含量的增加可能是由于淀粉颗粒大小的增加。此外,淀粉颗粒的形状和密度在不同品种之间是不同的,FD15中多角形占多数,而FD18中椭圆形或圆形占多数,且凤豆18号中淀粉颗粒的密度大于凤豆15号。这可能与遗传因素、胚乳的充实程度、蛋白质含量及外界环境有关[34-35]。

图1 不同食用阶段蚕豆的扫描电子显微照片(1000×)Fig.1 Scanning electron micrograph of broad bean in different edible stages(1000×)注:A1～A3表示凤豆15号的S1～S3阶段;B1～B3表示凤豆18号的S1～S3阶段。

3 结论

两个未成熟蚕豆品种中含量最高的矿物质均为K、Mg、Ca、Zn,并均能检测到少量的Fe、Cu和Mn,均未检测到Cr,且大部分矿物质在种皮中的含量高于胚中;大体而言,矿物质含量在两个未成熟蚕豆品种的种皮和胚中均随食用阶段的延后逐渐降低;蚕豆蛋白中氨基酸种类及含量丰富,其中总EAA含量范围为2.65～27.86 g/100 g蛋白质,占TAA含量的12.80%～37.35%;大部分单个氨基酸和TAA含量随着食用阶段的延后不断增加,且FD18中TAA含量和大部分EAA(Leu、Ile、Val和Met)的含量高于FD15,Met和Cys为限制性氨基酸;由相关性分析结果表明,未成熟蚕豆中氨基酸与矿物质之间没有明显的相互作用;微观结构观察结果显示了蚕豆淀粉粒在不同食用阶段过程中的变化,蚕豆淀粉颗粒的大小随食用阶段的延后逐渐增加,这表明蚕豆胚中淀粉含量的增加可能是由于淀粉颗粒大小的增加。此外,淀粉颗粒的形状和密度在不同品种之间是不同的,FD15中多角形占多数,而FD18中椭圆形或圆形占多数,且凤豆18号中淀粉颗粒的密度大于凤豆15号。