慢性肾脏病患者补充叶酸和维生素B12的研究进展

黄 力综述，葛永纯审校

0 引 言

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)发生率和死亡率显著高于普通人群，且预期寿命低，特别是接受血液透析的终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)患者，死亡风险较正常人群高10～50倍[1]。有研究早已证实高血压、血脂异常和糖尿病是心血管事件的传统危险因素。近年来，人们越来越关注非传统心血管危险因素，特别是氧化应激、内皮功能障碍、慢性炎症、血管钙化、慢性肾脏病矿物质和骨异常和高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)等[2]。“同型半胱氨酸假说”源于临床上对先天性同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)代谢异常的观察，这类患者由于先天性胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)的缺乏，血中Hcy异常升高(>100 mmol/L)，可快速进展至动脉粥样硬化，发生血栓栓塞性事件。然而对血清Hcy水平升高与CVD风险和死亡率之间关联的研究尚未得出一致结论[3]。研究发现CKD和ESRD患者的血清Hcy水平明显升高，且与生存预后相关。HHcy作为该人群的CVD和死亡风险因素仍有待充分阐明。叶酸和维生素B12为Hcy代谢过程中相关酶的必需辅因子，其稳态失衡可能与心血管风险和CKD进展直接相关。本文主要就CKD患者Hcy、叶酸和维生素B12的代谢途径，以及叶酸和维生素B12缺乏作为心血管事件和CKD进展危险因素的已有证据，探讨CKD和ESRD患者是否需要补充叶酸和维生素B12。

2 同型半胱氨酸代谢

Hcy是一种含巯基的氨基酸，不参与蛋白质合成，是甲硫氨酸(蛋氨酸)的代谢产物。甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸，然后通过甲硫氨酸合成酶还原酶催化，转化为S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)，SAH水解释放出腺苷，生成同型半胱氨酸。S-腺苷甲硫氨酸是最重要的甲基供体之一，在不同的甲基转移酶催化下，可将甲基转移给受体，使其甲基化[4]。

Hcy的代谢包括两条不同途径：再甲基化和转硫化。在再甲基化途径中，甲硫氨酸通过甲硫氨酸合成酶(enzyme methionine synthase, MTS)催化，维生素B12作为辅酶，与5-甲基四氢叶酸反应，生成甲硫氨酸和四氢叶酸，后者是叶酸的活性形式，转化为5,10-亚甲基四氢叶酸后，通过亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)转化为5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-MTHF)，继续为同型半胱氨酸提供甲基转化为甲硫氨酸[4]。同型半胱氨酸代谢的另一途径是转硫化。首先，同型半胱氨酸在CBS的作用下与丝氨酸结合形成胱硫醚，维生素B6是该过程的辅因子，胱硫醚通过胱硫醚赖氨酸酶水解成半胱氨酸和α-酮丁酸。α-酮丁酸转变成琥珀酸单酰辅酶A，通过三羧酸循环生成葡萄糖[5]。Hcy主要在肝和肾中代谢，在血液中以还原和氧化形式存在，其中氧化形式存在的Hcy中80%～90%与蛋白质结合，10%～20%以二硫化物形式存在，以游离还原形式存在的Hcy不足1%[4]。正常Hcy血浆水平<10 mmol/L，10～16 mmol/L为轻度高同型半胱氨酸血症，而>100 mmol/L为严重高同型半胱氨酸血症。

Hcy代谢依赖于叶酸(维生素B9)和维生素B12(钴胺素)，如果体内叶酸、维生素B12缺乏，则Hcy代谢障碍，导致血浆Hcy水平升高。在生理条件下，Hcy经肾清除很少，只有非蛋白质结合的Hcy经过肾小球滤过，大部分被肾小管重吸收，并被氧化成二氧化碳和硫酸盐。

2 CKD患者叶酸和维生素B12代谢

CKD患者血Hcy水平较普通人群升高，HHcy发生率为85%～100%，血肌酐水平与血浆Hcy水平成显著正相关，eGFR与血浆Hcy水平成负相关。虽然游离Hcy由于其分子量小可通过肾小球滤过屏障，但其大部分(约90%)以蛋白质结合形式存在于血液循环中。研究发现临床稳定的肾移植受者HHcy发生率仍高于正常人群，提示eGFR改善并不能使血浆Hcy完全恢复至正常水平[4]。参与Hcy代谢的主要酶(MTS、CBS)主要存在于肾中，因此Hcy转硫化和再甲基化途径可能受CKD的影响。CKD患者Hcy水平增高的原因为肾参与的代谢紊乱，而非单纯肾小球滤过率下降所致。对非糖尿病和糖尿病CKD患者的稳定同位素研究显示，Hcy的转硫化和再甲基化异常均可导致其代谢清除受损[6-7]。Garibotto等[8]发现肾静脉SAH浓度显著低于同一受试者相应的肾动脉值降低0～40%(P<0.001)，其差值是肌酐下降值的2倍，但同时尿液SAH排泄率却低于肌酐，表明肾代谢对SAH清除起重要作用。

此外，维生素B12、叶酸缺乏和Hcy代谢过程中相关酶的基因多态性均会导致Hcy升高。CKD患者的代谢异常，如酸中毒、免疫炎症和激素紊乱，以及合并症和多种药物治疗、厌食、腹泻、肠黏膜通透性增加和肠道菌群紊乱均会导致营养不良，叶酸和维生素B12缺乏[9]。

尿毒症患者叶酸的转运速度减慢，即使血浆叶酸水平正常，组织对叶酸的摄取率也可能会有所改变[10]。事实上，血清叶酸浓度并不代表组织的叶酸储存，而是反映近期膳食中维生素的摄入量。红细胞叶酸浓度是评价叶酸代谢的更好指标。Bamonti-Catena等[11]发现在112名透析患者中，超过80%患者红细胞叶酸水平在正常范围内，但只有37%患者血清叶酸水平正常。根据目前对血清叶酸的测量标准，血液透析和腹膜透析患者的叶酸缺乏发生率可能会被高估[12]。

血液中的维生素B12主要以蛋白结合形式存在，游离维生素B12可忽略不计。大约20%的维生素B12与钴胺素转运蛋白结合转化为活性形式，转运至细胞内。在CKD患者中，尿中的钴胺素转运蛋白丢失增加且近端小管重吸收减少，尽管总维生素B12水平正常，但功能性维生素B12缺乏，且功能性维生素B12与血清维生素B12水平缺乏关联。有学者认为甲基丙二酸和Hcy是判断维生素B12功能的关键生物标志物，甲基丙二酰辅酶A变位酶将甲基丙二酰辅酶A转化为琥珀酰辅酶A，进入三羧酸循环，甲硫氨酸合成酶将Hcy转化为甲硫氨酸，维生素B12是其辅酶，在转化过程中起重要作用。即便如此，甲基丙二酸和Hcy仍然不能准确预测功能性维生素B12的水平[13]。

3 叶酸和维生素B12代谢与MTHFR 基因多态

MTHFR催化5,10-甲基四氢叶酸转化为5-MTHF，在叶酸和Hcy代谢中发挥重要作用。参与同型半胱氨酸-甲硫氨酸途径的几种基因多态性可导致高同型半胱氨酸血症，目前研究最多的MTHFR基因突变位点为C677 C>T, 1298A>C, 1317T>C, 1793G>A。677C> T是MTHFR的最常见错义突变，发生率为40%[14]。尽管一些研究证实MTHFR 677 C> T基因型与肾转归无关[15]，但却发现MTHFR 677 C> T基因型增加ESRD患者的心血管事件风险[16]。Trovato等[17]发现在630名意大利白种人受试者中，接受血液透析的ESRD患者中MTHFR 677 C> T和1298 A> C发生频率较低，提示这些基因变异可能对肾功能进展具有保护作用。

补充叶酸和维生素B12对血液透析患者的临床价值存在争议，这可能取决于MTHFR的多态性。Anchour等[18]最近在132名血液透析患者的前瞻性队列中证实MTHFR多态性与补充叶酸和维生素B12降低Hcy的反应性相关。Tremblay等[19]在一项对168例血液透析患者的前瞻性研究中发现，TT基因型携带者基线Hcy水平更高，静脉补充叶酸后Hcy下降幅度显著高于其他基因型。有研究表明血液透析患者血清叶酸水平和MTHFR的常见突变(ala-val)之间存在交互作用，在血清叶酸水平更高的情况下(29.2 ng/mLvs6.8 ng/mL)，MTHFR多态性才与血浆Hcy水平相关[20]。

4 补充叶酸和维生素B12对CKD进展的影响

现有的观察性研究显示HHcy与CKD发生和进展风险存在相关性，而干预性临床研究却并未发现补充叶酸、维生素B12可延缓CKD进展。

中国卒中一级预防试验(CSPPT)纳入无卒中或心肌梗死史的成人高血压患者20 702例，评估了MTHFR基因型和基线叶酸水平的相关性，及接受叶酸治疗的临床获益[21]。肾脏亚研究分析比较了依那普利联合叶酸治疗或单用依那普利治疗对高血压人群肾功能下降风险的影响[22]。该研究纳入eGFR>30 mL/min/1.73 m2的患者15 104例，随机接受依那普利10 mg联合叶酸0.8 mg或单用依那普利10 mg治疗。与非CKD患者相比，CKD患者基线血清Hcy水平更高。经过4年随访后，与依那普利组相比，依那普利联合叶酸组CKD进展风险降低21%，eGFR下降率降低10%。亚组分析显示基线CKD患者(定义为eGFR <60 mL/min或存在蛋白尿)接受依那普利联合叶酸治疗对改善肾功能下降和降低全因死亡率更为显著。MTHFR 677 C> T多态性TT型患者Hcy降低幅度最大，而CC / CT基因型患者下降幅度较小。进一步亚组分析提示伴糖尿病的CKD患者接受依那普利联合叶酸治疗使CKD进展风险降低更为显著。这是第一个在无叶酸强化的人群中观察到叶酸治疗对肾保护作用的研究。

然而，既往叶酸联合维生素B12的干预性研究却并未发现一致性的肾保护作用。HOST试验是一项双盲、安慰剂对照试验，2056例eGFR≤30 mL/min/1.73 m2的CKD患者被随机分配到高剂量叶酸(40 mg)联合维生素B12(2 mg)、维生素B6(100 mg)治疗组或安慰剂对照组，中位随访3.2年。维生素治疗组Hcy水平显著降低，但未能延迟晚期CKD患者开始透析的时间[23]。DIVINe试验纳入238名糖尿病肾病患者，随机分配至2.5 mg叶酸、25 mg维生素B6、1 mg维生素B12治疗组或安慰剂对照组[24]。结果显示，随访2.6年后，与安慰剂对照组相比，维生素治疗组GFR降低更多，心血管事件增加。

为何上述大规模RCT得出不一致的结论，其原因可能是多方面的。首先，不同研究的基线叶酸水平不同(CSPPT肾脏亚研究为7.7 ng/mL，DIVINe和HOST研究分别为15和16.5 ng/mL)，补充叶酸对肾结局的有益假设在基线叶酸水平低的患者中可能更强；其次，补充维生素B的剂量不同可能会影响试验结果，HOST研究中补充后血叶酸水平可达2000 ng/mL，而CSPPT试验中叶酸平均水平仅为23 ng/mL，血清中未代谢的叶酸可能存在潜在毒性；最后，上述研究中研究对象和CKD的程度不同，DIVINe试验纳入糖尿病肾病患者；HOST研究人群是晚期CKD患者，疾病负担重，这可能削弱了补充B族维生素的潜在疗效，而CSPPT肾脏亚组研究证明叶酸治疗对CKD进展的益处可能与选择了轻中度CKD人群有关。此外，上述研究选择了不同的研究人群，CSPPT试验选择了无叶酸谷物强化的人群(中国)，而DIVINe和HOST研究选择了叶酸强化的人群(美国、加拿大)。

5 补充叶酸和维生素B12对CKD和ESRD患者CVD和死亡率的影响

在非CKD的HHcy患者中，补充叶酸和维生素B12可降低Hcy，并降低死亡率和心血管事件风险。CKD特别是ESRD患者血清Hcy明显升高，针对能否通过干预Hcy减少心血管事件的发生率和死亡率也展开了大量研究。然而，在这些研究中，补充叶酸和维生素B12降低心血管事件发生率和死亡率的效果并不显著。此外，有效的叶酸和维生素B12补充剂量、补充方法在不同患者中也没有达成统一共识。

一项纳入11个回顾性研究，12个前瞻性观察研究和5个干预性临床试验(共5123例患者)的Meta分析显示，血Hcy水平升高是无叶酸补充和谷物强化的ESRD患者发生CVD和死亡的危险因素[25]。未接受B族维生素(叶酸、维生素B6、维生素B12)治疗的ESRD患者Hcy水平约为35 μmol/L，而接受叶酸治疗或谷物强化的患者Hcy水平约为25 μmol/L。另外有研究高剂量的叶酸联合维生素B12、维生素B6治疗虽然降低了血清Hcy水平，但主要终点全因死亡率并未显著下降，次要终点心血管事件死亡率、截肢和血管通路血栓形成发生率亦无明显降低[23]。在Righetti等[26]开展的为期一年安慰剂对照、非盲法随机对照临床试验中，入组的81名维持性血液透析患者随机分为安慰剂组，叶酸5 mg/d治疗组和15 mg/d治疗组，结果显示与安慰剂组相比，叶酸治疗有降低新发心血管事件的趋势，但无统计学意义，且叶酸治疗组没有使患者生存获益，只有12%的患者治疗后血清Hcy达到了正常水平。一项观察补充大剂量叶酸能否延缓慢性肾衰竭患者动脉粥样硬化，降低心血管事件的双盲、随机对照试验中，315例患者随机分为叶酸15mg/d治疗组或安慰剂组。叶酸治疗组12个月后红细胞叶酸水平增加三倍，且与tHcy水平呈负相关[27]。但中位随访3.6年后，叶酸治疗组在全因死亡率、心血管死亡率和动脉粥样硬化事件(颈动脉内膜中层厚度)进展方面并无明显优势。Heinz等[28]设计了一项针对650例维持性血液透析患者的多中心研究，患者随机分为治疗组(5 mg叶酸、50 μg维生素B12、20 mg维生素B6)和安慰剂对照组，每周3次透后服用，随访2年后，两组间全因死亡率、致命或非致命的心血管事件发生率无明显差异。事后分析显示治疗组患者不稳定型心绞痛发生率显著降低。

在上述试验中，为了预防叶酸和维生素B12缺乏，有些试验排除已知叶酸、维生素B12缺乏需要额外补充的患者，有些试验对照组中仍有小剂量叶酸和/或维生素B12的补充，这些设计也许会影响试验结果。尽管现有试验表明药物治疗(叶酸，维生素B12和维生素B6)可使同型半胱氨酸水平降低，但CKD和ESRD患者的死亡率和心血管事件发生率并未明显降低。因此，有学者指出，同型半胱氨酸也许是CVD风险的生物标志物，而非引起CVD的原因。

6 结 语

CKD患者血Hcy水平较普通人群升高，其原因为肾参与的代谢紊乱，而非单纯肾小球滤过率下降所致。MTHFR的多态性与叶酸和Hcy代谢有关。然而，目前尚无足够循证医学证据表明CKD和ESRD人群中HHcy、叶酸和维生素B12的变化与CKD进展、CVD和心血管死亡相关，因此，这些因素尚不能作为CKD患者延缓肾病进展和降低死亡率的治疗目标，但在无叶酸强化的人群中，叶酸治疗显示出对肾的保护作用。