自噬在视网膜光损伤中的作用研究进展△

邓晓敏 彭佳媛 吴蔼林 韩彬 余小平

细胞自噬(autophagy)是一种对细胞生存、分化、发育和胞内代谢平衡都至关重要的溶酶体降解途径。其通过自噬小体和溶酶体以“自我吞噬”的方式回收蛋白质和能量，清除受损细胞器并降解入侵细菌[1]。细胞自噬被分为3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[2]。其中巨自噬被认为是自噬的主要亚型，也是目前研究最广泛的自噬形式，本文中提到的自噬是指巨自噬。生理水平的自噬可抵御外部刺激的压力，维持细胞内环境稳态。但特殊情况下，自噬或自噬相关蛋白可能促进细胞凋亡或坏死，自噬已被证明可因过度降解细胞质而导致自噬性细胞死亡[3]。Zhou等[4]研究发现，自噬对维持视锥细胞的功能和长期生存，支持其代谢需求和抗应激能力，在视网膜退行性疾病中具有保护作用。基础自噬通过维持正常细胞的基因组稳定性而发挥抑癌作用。可一旦肿瘤形成，不平衡的自噬将有助于肿瘤微环境下癌细胞存活，并促进肿瘤生长发育[5]。在乳腺癌化学治疗中，自噬与凋亡相互作用既可产生治疗抵抗，也可促进癌细胞死亡[6]。这些现象充分体现了自噬在不同疾病和机制中的两面性。本文仅讨论了自噬在视网膜光损伤中的两面性。

1 自噬的特点及相关信号通路

1.1 自噬的特点自噬是有别于凋亡的另一种细胞程序性死亡，是真核细胞特有的生命现象，在细胞生长、发育与疾病发生发展中起重要作用。自噬在遗传上具有高度保守的特点，是细胞内产生双膜自噬泡将胞质内容物传递给溶酶体降解的动态过程[7]。

自噬基本过程大致分为3个阶段：(1)自噬前体形成阶段：这一阶段的自噬诱导主要是通过由ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，酵母Atg1同系物)、FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD，酵母Atg17同系物)、Atg13 3种蛋白形成的ULK1复合物与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)之间相互作用实现的[8]。mTORC1活化抑制细胞自噬，而mTORC1活性被抑制时，自噬体逐渐成核并延伸[1]。(2)自噬小体形成阶段：自噬小体形成是自噬的中心环节。自噬前体在p62(sequesto-some-1)、LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)等蛋白作用下逐渐延长，识别并包裹胞浆中所需降解的底物，最终收口成为密闭、球状自噬小体。在此过程中p62主导底物识别，LC3主导双膜延伸。LC3的脂质形式LC3-Ⅱ常被视为自噬活性标志，LC3-Ⅱ表达升高，说明自噬体形成或自噬增加[9]。(3)自噬体成熟阶段：主要是指自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并在溶酶体酸性蛋白酶作用下降解其内容物的过程。自噬涉及多个基因和细胞信号通路。其细胞信号通路并非孤立，而是处于非常复杂的信号网络中。自噬通路与凋亡、氧化应激等通路均有交叉，且在一定情况下相互调节。

1.2 mTOR通路mTOR(mammalian target of rapamycin)即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，是一种进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以调控细胞周期、生长与增殖，也是细胞自噬调控的关键蛋白[10]。mTOR存在2种复合形式，根据其对雷帕霉素的敏感性差异分为mTORC1和mTORC2。其中对雷帕霉素敏感的mTORC1是调控自噬的主要因素，也是多条信号通路的汇聚点。

影响或调控mTOR信号通路的因素尚未被完全阐明。目前研究较多的有PI3K/AKT/mTOR通路和AMPK/mTOR通路。生长因子主要通过PI3K/Akt通路调节mTOR活性。正常情况下，细胞外的生长因子和细胞因子可通过受体酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K催化PIP2转化为PIP3，并在PDK1的协同下激活Akt。活化的Akt磷酸化TSC2，使其从TSC1/TSC2复合物中解聚，以增强Rheb活性，从而正向调控mTOR。同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)可使PIP3去磷酸化，从而逆转PI3K所催化的反应，是PI3K/AKT途径的负向调节因子[11]。营养物质和能量则主要通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated kinase,AMPK)通路调节mTOR的活性。一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)值升高可活化AMPK，被活化的AMPK作用于TSC1/TSC2，进而抑制mTOR活性。

1.3 Beclin 1通路Beclin 1是酵母菌ATG6/VSP30在哺乳动物的同源基因，亦是最早被发现的自噬调节关键因子。Beclin 1具有3个重要结构域：BH3、卷曲螺旋结构域(coiled coil domain，CCD)和进化保守结构域(evolutionarily conserved domain，ECD)。Beclin 1可通过这些结构域与多种蛋白结合形成复合体，抑制或促进自噬发生[12]。例如，Beclin 1可通过其CCD和ECD结构域与Vps34结合，形成Vps34-Beclin1复合体，促进自噬体膜的形成与转运。抗紫外线相关基因产物蛋白(ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG)可直接与Beclin 1的CCD结构域结合，促进自噬体成熟，而其亚单位Rubicon与Beclin 1结合，则抑制自噬体成熟[13-14]。研究显示，细胞凋亡相关因子Bcl-2也是重要的自噬调节蛋白，因其含有与Beclin 1相同的结构域BH3，故Bcl-2可竞争性抑制Beclin 1与Vps34的结合从而抑制自噬[15]。由此可见，Beclin 1在自噬体形成的过程中起着重要作用，并与凋亡通路相互影响。

1.4 丝裂原活化蛋白激酶途径丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protain kinase，MAPK)信号通路高度保守，广泛存在于真核细胞生物中，并对其细胞周期、基因表达发挥重要作用。MAPK包括3个平行激酶：JNK、p38和ERK1/2，其都被认为与自噬导致的细胞死亡有关。研究证明，ERK可通过抑制mTORC1触发自噬，而 ERK特异性磷酸酶对光致氧化应激产生的活性氧ROS敏感[16]。除上述通路外，泛素样蛋白系统，miRNA、p53等也对自噬信号通路有一定调节作用[17]。

2 自噬在视网膜光损伤中的作用

2.1 视网膜光损伤中自噬的保护作用自噬及其相关蛋白参与了一系列感光活动，且在视网膜神经节细胞层，内、外核层，及视网膜色素上皮细胞均有高表达[18]。本课题组前期研究发现，以凋亡为靶点，黑米花青素可改善大鼠视网膜光化学损伤[19]。以自噬为靶点，飞燕草素可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬从而促进乳腺癌细胞自噬性死亡[20]。自噬亦或可成为视网膜光损伤防治的新研究方向。

光感受器细胞变性和死亡是光致视网膜损伤的主要病理改变，也是一系列相关疾病，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)导致失明的原因[21]。

2.1.1 AMD中自噬的作用蓝光易折射，是引起眩光导致视疲劳的一大原因。其中短波蓝光易导致视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)早期损伤，是干性AMD 的重要危险因素[22]。Xia等[23]利用老年C57小鼠视网膜和人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial cells，hRPE)为模型，以蓝光诱导损伤。损伤后第1天电镜下观察到：hRPE线粒体受损，视网膜外节段结构紊乱。蛋白质印迹实验(Western blotting，WB)结果显示，自噬相关蛋白PERK、LC3、Beclin-1上调，提示自噬启动。损伤后第5天，电镜观察到视网膜和光感受器损伤恢复。WB结果显示PERK、LC3、Beclin-1下调。由自噬相关蛋白的表达变化可推测：自噬参与了视网膜光损伤的早期修复。

大剂量光照可导致RPE中玻璃疣(Drusen，位于RPE和Bruch膜之间的一种异常沉积物)和脂褐素的积累。二者均是AMD发展的危险因素[24]。Zhang等[25]发现，脂褐素的主要成分A2E诱导细胞炎症因子表达，促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)的分泌，并降低RPE生存率。增强自噬可减少炎症因子和VEGFA的分泌，对RPE细胞抵抗A2E毒性具有保护作用。

视锥细胞是视网膜光感受器中对色彩视觉和视觉感知至关重要的细胞，相对于视杆细胞，视锥细胞在较强光线下仍能正常工作，且有抗强光损伤能力。AMD后期，因视锥细胞大量丢失，患者视力受到严重损伤甚至失明。Zhou等[4]敲除自噬基因Atg5阻断自噬后发现，视锥细胞的抗强光伤害的能力降低。说明自噬有助于视锥细胞抗强光损伤，且在AMD后期起到了保护视力的作用。

Cai等[26]发现MicroRNA-29可通过抑制mTORC1活性，促进自噬，增加RPE中Drusen的清除率。由此可见，MicroRNA-29有可能成为治疗眼部疾患中RPE变性的新治疗策略。

2.1.2 RP中自噬的作用RP是视网膜变性最常见的临床亚型之一，是一种神经退行性疾病。因RP影响光感受器的存活能力，故最终可导致失明[27]。Yao等[28]发现，光损伤促进具有细胞毒性的视觉转导蛋白生成，其细胞毒性可导致视网膜变性。他们敲除自噬基因Agt5中断自噬，发现视觉转导蛋白累积，加速了视神经元退化和视网膜变性。而同时敲掉Agt5和视觉转导蛋白的基因Gnat-1，则发现视杆细胞变性率降低，光感受器保存良好。自噬有助于及时清除视觉转导蛋白，从而达到保护光感受器的作用。

2.2 视网膜光损伤中自噬的损伤作用自噬在许多疾病进程中体现着双刃剑效应。近年研究显示，视网膜光损伤中自噬不仅有以上保护作用，在一定条件下也有加重损伤增加细胞死亡率的效果。Zhang等[16]研究发现，以可见光照射小鼠光感受器细胞(661W细胞)可激活MAPK通路，导致显著自噬，细胞死亡率上升。而分别使用通路抑制剂阻断MAPK的3个平行激酶途径：JNK、p38和ERK1/2后发现：ERK1/2是光诱导661W细胞死亡的关键，通过抑制ERK通路抑制了自噬，可明显降低661W细胞的光致死率。此研究不仅证明了自噬在视网膜光损伤中可起到加重损伤的作用，还为阻断自噬性损伤找到了可能的干预靶点。目前关于自噬对视网膜细胞负面作用的研究较少，有待未来进一步探索。

虽然目前为止，视网膜光损伤的具体机制尚不明确，但如果能以自噬为切入点加以研究，或可为视网膜光损伤相关疾病的防治提供新思路。