PD-1与PD-L1在结直肠癌的研究现状

廖世民，范晶，王子卫，何苗

(1.重庆大学附属肿瘤医院 重庆市肿瘤研究所 重庆市肿瘤医院胃肠肿瘤中心，重庆 400030 2.重庆医科大学附属第一医院a.急诊科b.普通外科，重庆 400016)

肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病，伴随人口老龄化，其发病率和患病率呈上升趋势[1]。当前实体肿瘤的治疗采用以手术为主，化疗、放疗、靶向治疗、中医药治疗为辅的综合治疗，但疗效欠佳。免疫治疗是近年肿瘤治疗领域的新热点[2]。2018年诺贝尔生理学或医学奖也授予了研究肿瘤免疫治疗的美国和日本科学家，人类治疗肿瘤的观念也发生改变。程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death-1，PD-1)、程序性细胞死亡配体-1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)及其抑制剂是肿瘤免疫治疗的研究热点。PD-1常存在于免疫细胞表面，与其配体PD-L1结合后产生负反馈信号，抑制免疫功能。此功能作为保护机制使宿主免受自身免疫系统的错误攻击，但部分肿瘤细胞也可能利用此机制(过表达PD-L1)逃避免疫系统监控。PD-1/PD-L1抑制剂的作用是阻止负向反馈信号，激活免疫细胞对肿瘤细胞的监控。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是十分常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国部分地区仅次于肺癌，已成为第二大瘤种[3]，当前其免疫治疗尚处于探索阶段。现总结肿瘤免疫治疗的基础理论，介绍PD-1/PD-L1在CRC中的研究进展。

1 肿瘤免疫监控与逃逸

人体免疫系统的一项重要功能是识别和清除肿瘤细胞，即肿瘤免疫监控。此过程涉及3种免疫细胞：①抗原提呈细胞，以树突状细胞(dendritic cells，DCs)为代表，其功能是识别和摄取肿瘤产生的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，然后提呈给T淋巴细胞；②T淋巴细胞，被DCs激活，识别并攻击、清除产生TAA的肿瘤细胞；③B淋巴细胞，产生针对TAA的特异抗体。其他免疫调节细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、T调控细胞等。这些细胞与肿瘤周围基质细胞一起构成肿瘤免疫微环境，共同参与肿瘤免疫监控[4-5]。

虽然机体存在抗肿瘤免疫监控，但肿瘤细胞也存在逃逸免疫识别的机制。此机制可概括为：①部分清除(肿瘤细胞清除不完全)；②维持平衡(肿瘤细胞处于休眠或静息状态，但积累着遗传学和表观遗传学变异)；③逃逸增殖(肿瘤细胞已耐受机体的免疫监控，并逃逸免疫攻击)。逃逸免疫识别的机制由抑制T细胞免疫的检查点蛋白调控，包括细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4、PD-1、PD-L1、淋巴细胞激活蛋白3等[6]。由于免疫检查点抑制T细胞免疫，肿瘤细胞可利用免疫检查点抑制T细胞的免疫攻击，当前观点认为部分肿瘤组织PD-1/PD-L1的表达显著增强。

2 PD-1/PD-L1与肿瘤免疫

PD-1是免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，主要在T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、DCs、巨噬细胞的胞膜表达，而其配体PD-L1通常在肿瘤细胞表达,亦可在激活的T细胞和巨噬细胞表面表达。PD-L1与PD-1结合后可抑制T细胞增殖、分化以及分泌细胞因子。因抑制了T细胞的活性，T细胞的肿瘤免疫监控作用受损，导致肿瘤免疫耐受和逃逸[7]。

目前认为PD-1/PD-L1高表达可能与部分肿瘤预后不良相关，其高表达也是预测肿瘤抗PD-1/PD-L1免疫治疗疗效的标志之一[4-7]。研究发现，抗PD-1/PD-L1治疗对部分实体肿瘤疗效较好，这部分肿瘤的错配修复功能异常(mismatch repair deficiency，dMMR)导致了高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)，dMMR产生的大量变异肿瘤抗原诱导免疫细胞大量浸润(肿瘤免疫治疗的基础)[6-7]。肿瘤细胞激活免疫检查点信号如PD-1/PD-L1等抑制了T细胞免疫攻击，故针对免疫检查点的抑制剂如PD-1/PD-L1抑制剂Pembrolizumab，可通过激活T细胞的免疫攻击实现抗肿瘤的作用[8]。故肿瘤MMR状态以及PD-1/PD-L1的表达水平对判断免疫治疗效果至关重要。

不少抑制PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经上市，并用于不同恶性肿瘤的免疫治疗，如转移性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等。相对于其他免疫治疗，PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤疗效(包括有效率和持续时间)更显著，且毒副作用更小。

3 CRC的免疫微环境

在CRC中，相对于错配修复功能正常(mismatch repair-proficient,pMMR)/微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)的CRC，dMMR/MSI-H-CRC具有更积极的免疫微环境，CD8+和CD4+T淋巴细胞浸润肿瘤组织更明显[8]。在dMMR/MSI-H-CRC中，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的密度是pMMR/MSS-CRC的10～50倍[9]。但即使在如此积极的免疫微环境中，dMMR/MSI-H-CRC也未被免疫清除。一项研究分析了CRC细胞、TIL细胞、巨噬细胞的PD-L1表达情况后发现，dMMR/MSI-H-CRC组织高表达PD-L1，且主要在TIL等免疫细胞表达，并非是CRC癌细胞，这与黑色素瘤、肾癌、肺癌的PD-L1主要在癌细胞表达不同，而MSS-CRC几乎不表达PD-L1[8]。提示MSI-H-CRC可能通过增强PD-1/PD-L1信号通路抑制免疫监控，导致肿瘤的免疫耐受和逃逸。基于此，MSI-H-CRC可能是抗PD-1/PD-L1免疫治疗的候选疾病。

Cantero-Cid等[10]发现，CRC组织中存在大量CD14+单核巨噬细胞和CD4+淋巴细胞浸润，其中单核巨噬细胞表达PD-L1(肿瘤细胞并无PD-L1表达)，淋巴细胞表达PD-1。提取CRC患者外周血中的单核细胞、淋巴细胞与患者的癌细胞进行共培养，可诱导CD14+细胞表达PD-L1，导致T淋巴细胞衰竭，而使用PD-1抗体可恢复淋巴细胞增殖[10]，这也证实了CRC免疫微环境的特点。

4 CRC中PD-1/PD-L1的基础研究

4.1PD-1/PD-L1与表观遗传 表观遗传是指不涉及DNA序列改变的，并可随细胞分裂而遗传的基因组修饰和调节，DNA甲基化和微RNA是其中的重点。在CRC中作为癌基因的PD-L1可能受DNA甲基化和微RNA的调节。Elashi等[11]发现，CRC患者外周血中PD-L1显著升高，且PD-L1基因启动子存在异常DNA低甲基化，低甲基化程度与PD-L1升高程度密切相关。提示CRC患者PD-L1的表达可因DNA的异常低甲基化而增强，并认为抗PD-L1联合去甲基化抑制剂治疗CRC可能更有效。此外，Ashizawa等[12]研究发现，dMMR/MSI-H-CRC中的miR-148a-3p可直接与PD-L1的3′非编码区结合，并抑制PD-L1的表达。但miR-148a-3p在dMMR/MSI-H-CRC中的表达降低(与PD-L1高表达负相关)，若在T淋巴细胞和结肠癌细胞共培养模型中过表达miR-148a-3p，则可抑制癌细胞表达PD-L1，进而减少T细胞凋亡[12]。提示miR-148a-3p负向调节CRC细胞表达PD-L1，miR-148a-3p的减少将导致PD-L1表达的增强，进而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。

4.2PD-1/PD-L1与结肠癌干细胞 肿瘤干细胞是一种具有自我复制、自我更新和多向分化能力的肿瘤细胞，这类细胞具有成瘤能力，是肿瘤细胞增殖和形成转移瘤的基础。结肠癌干细胞的功能可能与PD-1/PD-L1的表达相关。Wei等[13]发现，CD133+CD44+的结肠癌干细胞高表达PD-L1，PD-L1通过增强“干性”基因的表达促进细胞自我更新；且体内外耐化疗药的结肠癌干细胞PD-L1的表达均显著增强；PD-L1还可增强结肠癌干细胞在裸鼠上的成瘤率。PD-L1可能是通过上调高迁移族蛋白A1(high mobility group AT hook 1,HMGA1)，激活HMGA1介导的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶信号通路，导致结肠癌干细胞扩增；相反，下调HMGA1可抑制PD-L1导致的肿瘤干细胞扩增，突显了HMGA1在PD-L1介导的结肠癌干细胞自我更新中的重要作用[13]。此外，PD-L1的表达与肿瘤干细胞标志物以及HMGA1的表达呈正相关[13]，所以PD-L1可通过激活HMGA1介导的信号通路维持结肠癌干细胞的自我更新。

4.3PD-1/PD-L1与MMR基因 MMR基因是从遗传性非息肉性大肠癌中分离出来的遗传易感基因，该基因突变会导致细胞错配修复功能缺陷，表现为复制错误或MSI，从而导致肿瘤发生。遗传性非息肉性大肠癌是MMR基因发生胚系突变所致的单基因显性遗传病，又称Lynch综合征，在部分MSI的散发CRC中也存在MMR基因突变。CRC中MMR基因的功能状态与PD-L1关系密切。Ahtiainen等[14]研究发现，PD-L1在癌细胞和免疫细胞中的表达重合率很高，在dMMR-CRC中，不论是癌细胞还是免疫细胞，PD-L1和PD-1的表达均显著强于pMMR-CRC。Liu等[15]比较pMMR-CRC与dMMR-CRC发现，dMMR-CRC组织中淋巴细胞浸润和PD-L1的表达均较pMMR-CRC更显著，并认为dMMR-CRC对免疫治疗敏感的原因是淋巴细胞浸润和PD-L1阳性表达。

Droeser等[16]发现，在pMMR-CRC中PD-L1也有一定程度的表达，且PD-L1的表达与CD8+淋巴细胞浸润、较早的T分期(肿瘤浸润肠壁深度)、无淋巴结或血管转移、更低的肿瘤分级、更好的预后等相关，因而pMMR-CRC中PD-L1的高表达可能是CRC预后较好的指标之一。Smith等[17]认为，对pMMR-CRC使用抗PD-1治疗也能获益，并认为T细胞对致瘤性基因突变的反应是普遍性。综上，PD-1/PD-L1在dMMR/pMMR-CRC中均有表达，但在dMMR-CRC中可能更显著。

5 CRC中PD-1/PD-L1的临床研究

5.1PD-1/PD-L1与CRC预后 PD-1/PD-L1与CRC预后的关系尚有争议。Li等[18]研究发现，高表达PD-L1与CRC患者总生存期缩短、无进展生存期缩短、肿瘤分化更低等相关，但与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分级分期、淋巴转移等无关。提示PD-L1高表达可能是CRC预后不良的分子标志物，也是临床采用抗PD-1/PD-L1治疗的依据。Shen等[19]认为，PD-L1高表达与CRC预后不良关系密切，且PD-L1高表达与CRC的淋巴结转移和肿瘤高分期相关。

但Li等[20]研究发现，PD-1/PD-L1的高表达与CRC相对较好的预后相关，特别是对于pMMR-CRC患者，这与Droeser等[16]的研究结果相近。Berntsson等[21]利用免疫组织化学研究发现，若结肠癌(包括左半、右半结肠癌)组织中浸润的免疫细胞高表达PD-L1，或右半结肠癌(除外左半结肠癌、直肠癌)中浸润的免疫细胞高表达PD-1，则患者的5年生存率更高，而癌细胞表达的PD-L1与CRC预后无关。Hamada等[22]发现，结肠癌组织中浸润的淋巴细胞若表达PD-L1则与肿瘤明显的MSI、高程度CpG岛甲基化、BRAF基因突变、肿瘤抗原升高等因素密切相关，但PD-1、PD-L1的表达与结肠癌预后并无显著关联。综上，PD-1/PD-L1与CRC预后的关系仍有待探索。

5.2放化疗与PD-1/PD-L1 放化疗是除手术外CRC最重要的治疗方式。Tominaga等[23]采用酶联免疫吸附法研究117例低位直肠癌患者放化疗前后血浆游离PD-1/PD-L1的水平发现，PD-L1在放化疗后明显升高，但PD-1变化不明显。Roxburgh等[24]研究了8例Ⅱ、Ⅲ期直肠癌患者发现，采用FOLFOX(奥沙利铂+氟尿嘧啶+亚叶酸钙)方案新辅助化疗4个疗程后，直肠癌组织PD-1/PD-L1的表达均较化疗前增强。Hecht等[25]也研究了放化疗对直肠癌PD-L1表达的影响，结果发现，放化疗可增加癌细胞PD-L1的表达率。Jomrich等[26]研究发现，大约17%的直肠癌组织在放化疗后出现淋巴细胞PD-L1表达增强，但直肠癌细胞PD-L1的表达变化不明显。以上研究提示，放化疗可能改变肿瘤免疫微环境，放化疗结合抗PD-L1治疗可能是进展期直肠癌更有效的治疗方案。

5.3抗PD-1/PD-L1的疗效 当前对CRC的抗PD-1/PD-L1治疗已取得进展。Capasso等[27]在人源化小鼠模型上研究抗PD-1治疗对人结肠癌细胞移植的影响发现，抗PD-1治疗可增强T细胞的抗肿瘤反应，并抑制结肠癌细胞的增殖。在MSI-H-CRC动物模型中这种反应更显著，且与肿瘤中更多的CD8+γ干扰素+T淋巴细胞相关[27]。

Ott等[28]研究发现，直肠肛管癌PD-L1的阳性表达率为74%(38/43)。采用PD-1抗体治疗24例PD-L1阳性肛管鳞状细胞癌患者，每2周给予10 mg/kg的Pembrolizumab，随访到治疗结束后56周发现，4例(17%)缓解，10例(42%)稳定，疾病控制率为58%，16例(67%)有药物相关不良反应，主要为腹泻、恶心、乏力，并无药物导致的死亡[28]，显示了Pembrolizumab治疗肛管癌的有效性和安全性。

Le等[8]采用Pembrolizumab治疗11例dMMR/MSI-H-mCRC患者、21例pMMR/MSS-mCRC患者及9例dMMR的非CRC患者，方案为10 mg/kg，每2周1次。结果发现，dMMR/MSI-H-mCRC组患者的客观有效率为40%(4/10)，20周时疾病无进展生存率为78%(7/9)；但pMMR/MSS-mCRC组客观有效率为0%(0/18)，20周时疾病无进展生存率仅为11%(2/18)。深入分析发现，Lynch综合征相关肿瘤(胚系突变)的客观有效率为27%(3/11)，而非Lynch综合征的dMMR肿瘤(包括CRC与其他肿瘤)的客观有效率为100%(6/6)[8]。提示Pembrolizumab治疗dMMR/MSI-H-CRC的有效率明显优于pMMR/MSS-CRC，且在非Lynch综合征的dMMR肿瘤(包括CRC与其他肿瘤)中可能疗效更显著。美国食品药品管理局于2017年底批准抗PD-1药物Pembrolizumab用于转移性MSI-H-CRC的临床治疗，后来Le等[29]研究一线化疗方案失败的MSI-H-mCRC患者，方案是每3周给予Pembrolizumab 200 mg，结果总体客观有效率为33%(21/63)，有2例甚至实现完全缓解，中位无进展生存期为4.1个月，1年无进展生存率达41%，1年总生存率达76%。另有学者使用Pembrolizumab联合mFOLFOX6(奥沙利铂+氟尿嘧啶+亚叶酸钙)化疗方案治疗30例不可切除的CRC(包括dMMR和pMMR病例)，结果15例实现完全缓解或部分缓解，1例dMMR病例实现病理缓解，14例保持稳定[30]。以上研究提示Pembrolizumab在CRC治疗中的价值。

Overman等[31]采用Nivolumab(纳武利尤单抗，一种PD-1抗体)治疗74例dMMR/MSI-H转移性CRC患者，方案为每2周给予3 mg/kg，随访至少12周发现，客观有效率为31%(23/74)，疾病控制率为69%(51/74)，其中8例的治疗有效时间持续了至少1年。用药1年的无进展生存率为50%，总生存率为73%。2017年8月美国食品药品管理局批准了Nivolumab用于dMMR/MSI-H转移性CRC患者的治疗。

Yanik等[32]研究了23例合并人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的直肠肛管癌患者发现，免疫细胞PD-L1的表达与免疫细胞的浸润密度和CD8+T细胞密度相关，但有无HIV感染却与肛管癌组织PD-L1表达、免疫细胞浸润程度以及构成无显著相关性。因而对于HIV感染的肛管癌患者也可以尝试抗PD-1/PD-L1免疫治疗。

6 展 望

近年来肿瘤的免疫治疗取得了重大进展，抗PD-1药物如Pembrolizumab已正式用于黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌等肿瘤的治疗。CRC的相关研究也正在积极进行中。当前观点认为，抗PD-1治疗的效果在dMMR/MSI-H-CRC中可能更好，美国食品药品管理局也批准Pembrolizumab、Nivolumab等抗PD-1药物用于转移性MSI-H-CRC的治疗。相信随着临床数据的积累，免疫治疗可能成为CRC除手术、化疗、放疗、靶向治疗之外的又一选择。当然，CRC的免疫治疗尚有很多疑问，如免疫治疗的时机，免疫治疗与手术、化疗、放疗、靶向治疗的关系以及联合运用方案，免疫治疗的疗效与毒副作用等，这些需要未来进一步探索研究。