吴英浪,路英杰,王晓云
(哈尔滨医科大学附属第四医院心内科,哈尔滨 150001)
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是导致人类死亡的主要疾病之一,是由内皮功能受损或内皮功能障碍引起并导致动脉硬化的一种慢性疾病,病机为血管壁中斑块形成[1]。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)由必需氨基酸甲硫氨酸衍生而来,不仅是蛋白质合成的基石,还是S-腺苷甲硫氨酸的前体。细胞中发生的几乎所有转甲基化反应均需要S-腺苷甲硫氨酸。研究表明,高Hcy水平可促进内皮功能障碍和动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的发生、发展[2]。Hcy与CVD风险之间可能至少部分根源于细胞内甲基转移过程缺陷。内皮细胞是血管壁稳态的主要调节因子,具有调节血管张力、通透性、凝血纤溶、炎症、细胞生长等多种功能[3]。这些功能的损害启动一系列事件,进而触发炎症反应,通常称为内皮细胞活化。有证据表明,Hcy通过干扰内皮细胞功能发挥不良作用[4],即Hcy会损害内皮细胞调节血管张力的能力。现就Hcy的生物合成和分解代谢进行综述,着重阐述高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)与内皮功能障碍形成的机制。
由甲硫氨酸生成Hcy是人类合成Hcy的唯一途径[5]。S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,AdoHcy)是Hcy的前体,可通过Hcy水解酶进一步转化为Hcy和腺苷,该反应可逆,且AdoHcy的合成反应易于水解反应,但由于Hcy和腺苷在生理条件下能迅速除去,因此有利于水解反应。此外AdoHcy也会积累,可能会抑制细胞的甲基转移反应。根据AdoHcy水解酶反应的动力学特征,细胞内Hcy的水平受到严格控制。目前广泛应用于Hcy监测的生化参数为血浆总Hcy,包括所有循环Hcy分子的还原或氧化形式。
Hcy可通过两种替代途径代谢:①通过转硫途径不可逆地降解。转硫作用是甲硫氨酸代谢的主要途径,主要发生在肝脏和肾脏,起始于Hcy与丝氨酸的缩合,胱硫醚-β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和磷酸吡哆醛作为辅助因子形成胱硫醚。胱硫醚在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase,CSE)作用下裂解成半胱氨酸和氧代丁酸。②以5-甲基四氢叶酸或甜菜碱作为甲基供体,将Hcy再甲基化为甲硫氨酸。在以5-甲基四氢叶酸为甲基供体的情况下,甲硫氨酸合成酶将甲基从5-甲基四氢叶酸转移至Hcy,形成甲硫氨酸和四氢叶酸。而甜菜碱依赖的再甲基化是利用非叶酸甲基供体和甜菜碱-Hcy甲基转移酶将Hcy回收为甲硫氨酸。
2.1一氧化氮合成障碍 一氧化氮是内皮细胞中重要的舒血管因子,由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化精氨酸氧化生成。研究发现,高水平Hcy可抑制NOS的作用,抑制一氧化氮合成,从而导致血管内皮受损,进而损伤血管内皮细胞[6]。此外,NOS也受精氨酸甲基化类似物的抑制,如L-单甲基-精氨酸和非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)。循环ADMA水平的升高与As性血管疾病相关,L-单甲基-精氨酸缺乏导致As的原因可能由于其在血浆中的水平明显低于ADMA[7]。另一种精氨酸类似物——对称二甲基精氨酸虽然不抑制NOS的活性,但与精氨酸竞争阳离子氨基酸转运体,因此其水平升高可能会破坏细胞内精氨酸的可用性和一氧化氮生成。大多数L-单甲基-精氨酸和ADMA在二甲基赖氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)的作用下水解为二甲胺和瓜氨酸,而氧化应激可降低DDAH的活性,从而引起ADMA升高。由于血浆总Hcy和ADMA的轻度升高与CVD的发病率相关,因此推测血浆总Hcy升高对内皮细胞的有害影响可能由ADMA介导。有研究认为,Hcy对内皮细胞的作用显著抑制了DDAH和NOS的活性,导致一氧化氮生成减少,这可能与DDAH2(内皮细胞中主要的DDAH亚型)的表达降低有关[8]。因此,抑制DDAH2的表达可能导致Hcy诱导内皮功能障碍。
2.2硫化氢信号通路的失调 硫化氢是一种内源性信号分子,可调控多种生理过程,并参与内皮细胞稳态的精细调控。CBS和CSE与硫化氢的生成密切相关。CBS催化半胱氨酸和Hcy合成硫化氢,CSE催化丙酮酸和硫代半胱氨酸的产生,然后硫代半胱氨酸被分解成硫化氢和半胱氨酸。正常情况下,CBS是脑血管系统中主要产生硫化氢的酶,而CSE/硫化氢途径主要在心血管系统中起作用[9]。硫化氢通过硫化作用作用于内皮细胞,在不同信号转导途径中发挥有益作用[10]。硫化氢通过抑制核因子κB途径,激活钾离子和钙离子通道,抑制血管炎症,且硫化氢可通过清除活性氧类(reactive oxygen species,ROS)和升级抗氧化防御机制降低内皮细胞中ROS的水平[11]。此外,硫化氢可上调很多抗氧化酶[如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶]的表达,内皮硫化氢的产生可介导血管的舒张作用,参与血压的生理维持,并可作为血管生成的内源性刺激物[12]。一氧化氮与硫化氢途径相互配合,维持了血管系统的稳态。
硫化氢的抗As特性与其在内皮细胞稳态中的作用相一致,硫化氢缺乏可能加速As,相反补充硫化氢可抑制As。有研究报道,在伴有HHcy的As小鼠中,硫化氢供体治疗后As斑块面积减小、巨噬细胞浸润减少和血清Hcy水平降低[13]。既往研究发现,外源性硫化氢降低了载脂蛋白E敲除小鼠的血管炎症、氧化应激和As斑块形成;通过激活CSE增加内源性硫化氢的产生与As的减少相关[14]。
硫化氢生物利用紊乱可揭示与HHcy相关的内皮功能障碍的进展和预后,HHcy可导致CSE和CBS下调,进而导致硫化氢耗竭,内皮功能恶化,随后引发与HHcy相关的血管疾病。外源性硫化氢可纠正内皮功能障碍,并能够保护这些细胞免受HHcy诱导的损伤[15]。以上研究表明,CBS缺乏可通过减少硫化氢诱导的血管舒张而导致内皮功能障碍。
2.3氧化应激 氧化应激在Hcy诱导的内皮功能紊乱和As中有重要作用。HHcy可以通过不同的分子机制诱导氧化应激,如调节ROS的产生或削弱相关的抗氧化系统[16]。
2.3.1调节ROS的产生 最具生理学意义的ROS分别为羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢。Hcy自氧化可产生羟基自由基和过氧化氢[17]。但自氧化在Hcy诱导的细胞氧化应激中的作用受到质疑,因为其他硫醇(如半胱氨酸)的水平较Hcy高得多,也可进行自氧化,但与氧化还原平衡受损无关。细胞超氧阴离子主要由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,Nox)、黄嘌呤氧化酶或线粒体电子传递系统产生。Hcy可上调HHcy小鼠中Nox的表达,有助于超氧阴离子的生成[18]。Nox由Nox家族基因编码,Nox2是内皮细胞的主要亚型,Hcy水平与Nox2在人内皮细胞中的表达存在相关性[19]。研究发现,Hcy与内皮型NOS的解偶联有关,可产生超氧阴离子[20]。超氧阴离子可被SOD转化为过氧化氢,并与一氧化氮反应生成过氧亚硝酸盐。ROS和过氧化氢是核因子κB的活化因子,可增强与HHcy相关的促炎反应。在培养的内皮细胞中,Hcy可直接或间接通过AdoHcy积累提高过氧化氢水平。羟基自由基是最活跃的细胞ROS,可由过氧化氢分解产生,可促进低密度脂蛋白(low-density lipoproteins,LDL)氧化,对于As过程至关重要。
2.3.2削弱相关的抗氧化系统 有学者也强调了抗氧化系统失衡在Hcy介导的氧化应激中的作用[21]。细胞中的抗氧化系统分为两种,一种包含了中和ROS和降低氧化应激的酶,如SOD、过氧化氢酶、GPx、硫氧还蛋白、过氧化物还原酶;另一种为非酶抗氧化剂,如谷胱甘肽和维生素A、C、E等ROS清除剂。谷胱甘肽是一种重要的细胞抗氧化剂,高Hcy水平与谷胱甘肽减少相关[22],同时也与HHcy患者体内维生素B12和维生素E的减少有关[16]。在HHcy小鼠和内皮细胞中,GPx(GPx-1、GPx-2)、SOD(SOD1、SOD2)和硫氧还蛋白的表达减少[17]。一项关于H型高血压患者的研究显示,与血浆Hcy水平正常的患者相比,总Hcy水平高的患者血浆中ROS和过氧化氢酶的水平较低[21]。Hcy相关的ROS或抗氧化蛋白表达变化的分子机制尚不完全清楚,有研究强调了HHcy期间AdoHcy介导的甲基化潜能改变的重要性,如AdoHcy积累介导的甲基化失衡可能干扰调控细胞氧化还原平衡关键因子的表观遗传机制[2]。
2.4脂蛋白代谢紊乱 As是一种常见病,脂质和脂蛋白代谢紊乱为其高危因素。LDL和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)是血浆中最丰富的脂蛋白,内皮功能障碍时,LDL进入内膜,在内膜内氧化并聚集在内膜下,巨噬细胞大量摄取氧化的LDL,最终形成泡沫细胞,而泡沫细胞是As斑块的主要成分。有报道显示,Hcy可引起氧化应激并导致LDL氧化[23]。Griffiths等[24]研究表明,从负载甲硫氨酸的人脐静脉内皮细胞中释放的Hcy可促进LDL的硝化,Hcy诱导的LDL硝化也与单核细胞摄取能力的增强有关。甲基化LDL消除了LDL受体对LDL的识别,而HHcy相关的低甲基化可能会降低甲基化LDL,从而增加As中单核细胞或活化的巨噬细胞对LDL的摄取。
与LDL相反,HDL的血浆水平与CVD呈负相关,Hcy增高可降低血卵磷脂胆固醇酰基转移酶和胆固醇酯转运蛋白的水平,使HDL的胆固醇逆转运效率降低,同时还可降低HDL颗粒中对氧磷酶1的活性、升高髓过氧化物酶活性,从而使HDL的抗炎和抗氧化能力下降[25]。Hcy还与受损的HDL代谢有关。张秦风等[26]研究发现,Hcy可通过降低对氧磷酶的水平减弱HDL的抗氧化功能,从而促进CVD的发生和发展。
2.5蛋白质N-同型半胱氨酸化 在蛋白质的生物合成过程中,Hcy可被甲硫氨酸-RNA合成酶错误利用,产生同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone,HTL),后者可通过酰胺键与蛋白质快速反应,随后产生的N-同型半胱氨酸化蛋白与HHcy相关的血管病理学有关。在生理水平的Hcy、甲硫氨酸以及叶酸存在下,人脐静脉内皮细胞能将Hcy转化为HTL,且转化程度与Hcy水平成正比[27]。HTL可通过内质网应激途径诱导细胞间黏附因子1和血管细胞黏附因子1信使RNA表达,从而损伤血管内皮功能,最终导致内皮功能紊乱[28]。HTL是以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。HTL可拮抗胰岛素受体酪氨酸激酶,从而抑制磷脂酰肌醇-3-激酶的磷酸化和糖原合成,这一效应可能是Hcy、高胰岛素血症与CVD联系的基础[29]。此外,HTL还可以修饰纤维蛋白原,从而引发纤维蛋白凝块结构与稳定性的血栓前改变[30]。对氧磷酶1基因存在多态性,可编码一种已知的在体外水解HTL的心脏保护酶,并可导致尿HTL水平升高[31]。尿HTL水平是近年来提出的一种新的急性心肌梗死危险预测指标,与传统危险因素的存在无关[32]。此外,血浆HTL水平与冠心病风险相关,因此Hcy向HTL的代谢转换和HTL引起的蛋白N-同型半胱氨酸化有可能在Hcy诱导的血管损伤中起一定作用。
2.6细胞低甲基化
2.6.1Hcy代谢紊乱与DNA甲基化 Hcy和Adohcy升高对DNA甲基化状态有不利影响。HHcy能引起DNA甲基化修饰,从而促进As形成[33]。DNA甲基化是基因表观遗传调控的重要机制,AdoHcy依赖的低细胞甲基化能力可引起HHcy环境下DNA甲基化受损,并导致与血管内皮功能障碍相关的基因表达模式紊乱。在体外培养的人血管平滑肌细胞中,Hcy可诱导典型的H19基因上游增强子CpG低甲基化[34]。其他具有顺式调节元件的基因座,其甲基化状态受Hcy和(或)AdoHcy水平升高的影响[35],包括促血管生成因子(血小板衍生生长因子)、参与细胞周期进程的基因(如细胞周期蛋白A和B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3)、参与胆固醇代谢的基因(如固醇调节元件结合蛋白1和LDL受体基因)、血管炎症反应基因(如白细胞介素-1B、白细胞介素-6、白细胞介素-8)、细胞间黏附分子1、编码细胞外抗氧化剂SOD的基因以及编码人端粒酶逆转录酶基因的启动子。
2.6.2Hcy代谢紊乱与RNA甲基化 Hcy代谢紊乱对RNA的甲基转移反应有影响。研究显示,腺苷RNA甲基化标记既可以通过酶解去除,也可进一步修饰[36],表明RNA甲基化是一个动态过程,可能参与细胞的适应机制,其中包括Hcy新陈代谢。RNA甲基转移酶使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,并被AdoHcy抑制,但很少有研究关注HHcy中RNA甲基化被扰乱的可能性。在体外培养的人内皮细胞中,AdoHcy的积累会降低携带硒代半胱氨酸的转运RNA的甲基化程度,从而导致硒蛋白亚群的表达发生改变,如GPx-1[37]。GPx-1是一种重要的硒蛋白,参与细胞的解毒和氧化还原调节,在HHcy中与内皮功能障碍有关。
2.6.3Hcy代谢紊乱与蛋白质甲基化 Hcy代谢紊乱也影响蛋白质的甲基化,这是一种翻译后修饰,参与转录控制、RNA加工、DNA修复、端粒维持以及信号转导等重要过程。细胞内的AdoHcy在人脐静脉内皮细胞积累引起的蛋白精氨酸低甲基化较DNA低甲基化更显著[38]。组蛋白甲基化是一种重要的染色质修饰,在动物中,甲硫氨酸在肝脏的利用情况与经典激活标记组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化的水平相关,也与基因表达的匹配变化相关[39]。在晚期As斑块中,人血管中的抑制标记组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基化和组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化减少,研究表明,AdoHcy蓄积降低整体组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化的水平,并激活核因子κB通路,导致黏附分子和炎症因子过表达,进而促进As[40]。以上研究表明,在HHcy环境下,细胞甲基化能力的紊乱会导致蛋白质的低甲基化,这可能是导致内皮功能障碍的原因之一。
表观遗传学揭示了基因在发育和疾病中的调控机制,特别是在代谢与表观遗传学相互作用的背景下。Hcy代谢和组蛋白甲基化相联系,组蛋白甲基转移酶需要S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。Hcy可通过多种机制引起内皮功能障碍,在内皮损伤和As的进展过程中发挥重要作用。最近的研究突出了Hcy代谢作为决定染色质动力学和表观遗传学关键因素的地位,并随着深度测序方法的可行性和成本效益的提高,或可能发展并扩展到内皮功能障碍的背景下。总之,Hcy代谢与内皮功能障碍的关系仍有待深入研究,随着研究的深入和医学技术的提高,Hcy或许可能为早期诊断并预防As提供更多方向,控制Hcy水平可能为相关疾病的诊治提供新思路。