类风湿关节炎合并间质性肺疾病相关生物标志物的研究进展

沈洲立，唐小蓉，沈思辰，张雅婷，沈杰,

(1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海市光华中西医结合医院关节内科，上海 200052)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种主要累及小关节的自身免疫性炎症性疾病，主要表现为慢性对称性多发关节炎和滑膜炎。在我国，RA的患病率为0.32%～0.36%，具有较高的致畸率和致残率[1-2]。RA引起的间质性肺疾病(interstitial lung disease,ILD)是其主要临床致死原因之一[3]。RA-ILD早期常无明显临床症状,极易被患者和医师忽略,当疾病进展至一定程度出现明显临床症状被发现时，肺间质纤维化(pulmonary interstitial fibrosis,PIF)多已不可逆，晚期疾病加重时肺泡壁可出现纤维素性和炎症渗出物，从而引发肺部感染和(或)肺部纤维化，最终导致呼吸衰竭[4-8]。RA-ILD预后极差，平均生存时间仅为3年，死亡风险是单纯RA患者的3倍[9]。超过60%的RA患者采用高分辨率CT可检测到ILD的发生，其中10%的患者有明显的咳嗽和气促等临床表现[10]。RA-ILD大多累及肺间质，包括支气管、血管周围、小叶间隔及肺泡间隔，在周身关节肿痛的同时，还伴有明显的呼吸系统症状，如咳嗽、胸闷、气促等，晚期可发生贫血、缺氧性肺动脉高压，甚至肺源性心脏病。胸部CT显示，RA-ILD患者存在不同程度的弥漫性病变，主要表现为不规则网状影、牵拉性支气管扩张、蜂窝征等[11]。RA-ILD的发病机制复杂，目前尚不十分明确，被认为是各种炎症细胞因子相互作用、相互调节导致的复杂结果。这些炎症细胞因子作用于肺部血管引起肺部血管炎症，破坏肺实质，诱导肺成纤维细胞异常增殖，最终导致细胞外基质大量堆积和正常肺泡结构消失，引发PIF[12]。因此，如果能找到与该疾病相关的生物标志物可为有效诊治RA-ILD提供一定帮助。

1 RA-ILD的相关基因

1.1人类白细胞抗原-DRB1(human leucocyte antigen-DRB1，HLA-DRB1) HLA-DRB1基因编码的蛋白属于HLAⅡ 类β链旁系。该分子为异二聚体，由1个α链和1个β链组成，均锚定在细胞膜上。HLA-DRB1在免疫系统中扮演重要角色，其可以从细胞外蛋白中提取肽呈递给辅助性T细胞。截至目前，HLA-DRB1与RA的易感性、严重程度及关节外表现的相关性在不同种族群体中均有报道[5]。有研究表明，HLA-DRB1蛋白第9位色氨酸和多态氨基酸位与RA-ILD的易感性有关，HLA-DRB1及其等位基因的表达与RA-ILD的发展密切相关[13-14]。HLA-DRB1等位基因可通过特殊表位与自身抗原结合，从而诱导活化辅助性T细胞2，促进B细胞向浆细胞分化，最终导致自身免疫性疾病的发生。HLA-DRB1基因可能通过帮助抗环瓜氨酸肽抗体生成影响疾病的易感性。近年来关于RA中HLA-DRB1单倍型的研究显示，由11、71和74位氨基酸定义的HLA-DRB1单倍型与RA的严重程度、死亡率和治疗反应相关[15]。虽然HLA-DRB1可能是RA-ILD潜在的生物标志物，但目前尚未有大规模的单倍型分析确定其与RA-ILD的关系。

1.2黏蛋白5B(mucoprotein 5B，MUC5B) MUC5B是一类黏蛋白，通常存在于鼻和肺气道表面的黏液中，参与气道防御反应。MUC5B启动子变异是特发性肺纤维化的最强遗传危险因子。研究发现，在至少50%的特发性肺纤维化患者中发现了MUC5B，而具有MUC5B个体的特发性肺纤维化的患病风险为30%[16-18]。MUC5B启动子rs35705950变异也是RA-ILD的强危险因素，其对于RA发展成为RA-ILD的影响与特发性肺纤维化相似。研究发现，RA-ILD患者的支气管细胞、肺部蜂窝状细胞以及内膜上皮细胞中存在MUC5B，提示MUC5B启动子变异可用于早期识别RA-ILD[19]。另有研究发现，MUC5B启动子变异可用于RA-ILD的临床检测，MUC5B变异风险可能也与RA-ILD的遗传背景有关[20]。

1.3自噬基因Beclin-1 在RA患者中，细胞自噬的增加与RA成纤维细胞样滑膜细胞相关[21]，可导致瓜氨酸蛋白产生，这是RA-ILD发生一个标志[22]。Beclin-1蛋白与Bcl-2或磷脂酰肌醇-3-激酶相互作用，可作为信号分子促进其他自噬相关蛋白集聚，在调节自噬与细胞凋亡中发挥关键作用[23-24]。有学者通过检测IPF和RA-ILD患者支气管肺泡灌洗液细胞中自噬相关分子基因和蛋白的表达发现，与IPF患者相比，RA-ILD患者支气管肺泡灌洗液细胞中自噬基因Beclin-1的表达增加，且Beclin-1 信使RNA的表达水平也明显高于IPF患者[25]。这提示自噬基因Beclin-1的表达可能参与了支气管肺泡灌洗液细胞与RA-ILD相关的自噬通路，但是要了解该病的发病机制以及治疗该疾病的新靶点仍需进一步研究。

2 RA-ILD的相关细胞因子

2.1转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) TGF-β1是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，是肺纤维化形成过程中的关键致纤维化细胞因子，参与肺纤维化的诱导及启动。TGF-β1可刺激成纤维细胞增生，增加胶原蛋白的合成，促进细胞外基质合成，从而引发PIF[26-28]。研究显示，TGF-β1可通过Smad依赖和非依赖途径激活并调控肺纤维化的形成，还可以刺激成纤维细胞和巨噬细胞合成促炎和致纤维化细胞因子，参与肺纤维化过程[29]。晋松等[30]研究发现，RA-ILD患者TGF-β1水平与肺功能存在明显关联，提示该细胞因子不仅可作为RA-ILD患者肺纤维化疾病活动度的指标，也是抗肺纤维化药物的作用靶点之一。但目前尚未有研究证实TGF-β1基因多态性与RA-ILD疾病活动度存在相关性。

2.2血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 血管的异常生成在RA-ILD的病程中扮演了十分重要的角色。在生理状态下，VEGF的少量表达可以帮助维持血管壁的正常状态和完整性；然而在病理状态下，VEGF可增加血管通透性，刺激肺部纤维化[31]。动物研究显示，博莱霉素诱导的小鼠纤维化的肺间质中VEGF的表达和肺泡中毛细血管的数目显著增加[32]。有研究提示，抗VEGF治疗可以有效缓解RA-ILD患者的肺纤维化，并减少肺组织内胶原的产生[33]，提示VEGF作为药物治疗靶点的潜在可能性。尼达尼布是抗肺纤维化的靶向治疗药物，可通过抑制成纤维细胞分化减轻肺纤维化程度[34]，达到延缓疾病发展的目的。但由于RA-ILD的发病机制尚未明确，影响疾病的因素复杂，故VEGF作为生物标志物在肺纤维化中的作用尚存在争议。

2.3纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor，PAI) PIF病理过程的重要环节包括肺部炎症反应介导的血管细胞损伤和凝血纤溶变化。纤溶酶原可在纤溶酶原激活因子(plasminogen activators，PA)的作用下向纤溶酶转化，从而具有胰蛋白酶样作用，进而降解多种细胞外基质成分[35]。PAI-1通过与PA结合，抑制PA的活性，促进体内肺间质纤维蛋白的异常累积，并最终导致肺部纤维化。研究显示，PIF小鼠体内PAI-1的表达显著增加，但当使用PAI-1基因敲除小鼠再次进行实验时发现，小鼠的纤维化程度明显减轻[36]。另有研究发现，ILD患者肺泡灌洗液中PA的含量和活性均出现了一定程度的下降，而PAI-1水平升高[37]。以上研究提示，PAI-1在促进纤维化的发展中起到十分重要的作用，抑制PAI-1的过表达可改善纤维蛋白积累，发挥抗纤维化作用。

2.4CC趋化因子配体[chemokine(C-C motif)ligand，CCL] CCL在维持免疫稳态中发挥重要作用。有研究发现，CCL参与了血管生成、慢性炎症以及自身免疫性疾病的发生[38]。CCL-18是一种趋化因子蛋白，主要由肺泡巨噬细胞产生，可刺激肺成纤维细胞产生大量的胶原蛋白，从而加速肺纤维化进程。CCL-19和CCL-21是趋化因子受体7的特异性配体。研究发现，RA患者血清中CCL-21和CCL-19的表达水平高于正常人，而RA-ILD患者血清CCL-21水平高于无肺间质受累的RA患者[39]。虽然研究中并未观察到RA患者与RA-ILD患者CCL-19水平的明显差异，但其对该病的影响可能在某种程度上与凝血-纤溶系统激活有关。以上研究提示，CCL-21可能参与了RA-ILD肺纤维化进程，且CCL-19、CCL-21有望成为RA-ILD治疗的新靶点，但仍需要更多的数据和研究去证实。

2.5白细胞介素(interleukin，IL) IL在介导免疫细胞成熟、活化、增殖以及免疫调节等一系列过程中发挥重要作用，此外还参与了机体的多种生理及病理反应。研究显示，IL-17和IL-33在肺组织纤维化的致病过程中起重要作用[40-41]。IL-17是一种重要的上游致炎症细胞因子，其表达水平在RA患者和RA-ILD患者中有显著差异[42]，提示IL-17可作为RA-ILD的监测指标。IL-33主要在成纤维细胞和内皮细胞表达，其升高会诱导肺成纤维细胞增殖。有研究表明，RA-ILD患者体内IL-33的水平显著高于单纯RA患者，说明IL-33参与了RA-ILD的发生及发展[43]。IL-6是肺纤维化的促炎因子和促纤维化因子，主要通过激活Janus激酶/信号转导及转录激活因子信号通路参与RA及RA-ILD的病理过程，而早期中和IL-6可改善患者肺纤维化的严重程度[44-46]，提示IL-6可能成为新的治疗靶点。

3 RA-ILD相关评估和预测因素

3.1丙二醛乙醛加合物(malondialdehyde-acetaldehyde adducts，MAA)和抗MAA抗体 MAA是氧化应激的高免疫原性产物，在氧化应激过程中由脂质过氧化产生，MAA在没有佐剂的情况下能够刺激机体对可溶性蛋白产生抗体反应，产生强大的抗MAA抗体，用以识别MAA表位和载体蛋白本身[47]。研究发现，MAA可刺激气道上皮细胞发生炎症反应和纤维化[48]。RA-ILD的病理机制包括炎症反应、诱导自身免疫反应、肺部纤维化以及氧化应激等多种复杂且相互关联的过程，并与MAA的促炎特性和促纤维化特性相关。研究表明，在瓜氨酸、CD19+B细胞和细胞外基质蛋白共定位的RA-ILD患者的肺组织中，MAA的表达水平较高[49]。同时研究还发现，RA-ILD患者的免疫球蛋白A和免疫球蛋白M型抗MAA抗体水平高于其他RA患者，也高于其他慢性肺部疾病患者[50]，表明MAA和抗MAA抗体介导的免疫反应可能在RA-ILD的发病中发挥重要作用，提示MAA可作为预测RA-ILD的有用生物标志物，但目前尚缺乏关于此方面的数据。

3.2赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase like 2，LOXL2) LOXL2属于赖氨酰氧化脱氨酶家族，可促进病理性基质胶原的交联，其在健康肺中的表达较少，但在肺纤维化组织中的表达水平较高[51-52]。此外，LOXL2还可调节纤维化疾病相关的细胞外和细胞内细胞信号通路[53]。发病时间<3个月RA-ILD患者的血清LOXL2水平显著升高，甚至在纤维化发生前就已经上调[54]，说明LOXL2可能对RA-ILD具有预测价值。

3.3肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine dei-minase，PAD) 瓜氨酸化及其调节失常在RA自身免疫反应、关节破坏中发挥重要作用，而瓜氨酸化过程依赖PAD的存在。来源于巨噬细胞和中性粒细胞的PAD-4在瓜氨酸化过程中发挥重要作用，PAD-4基因的异常可影响RA-ILD的发生发展，且PAD-4的单核苷酸多态性可能是RA气道异常的危险因素[13]。PAD-4的单核苷酸多态性可与吸烟等环境因素相互作用，加速RA-ILD的发展，但目前等位基因中单核苷酸多态性影响RA-ILD的机制尚未阐明。

3.4肺表面活性蛋白(pulmonary surfactant protein，SP)-D SP是由肺泡Ⅱ型细胞合成并分泌的一种脂蛋白复合物,具有降低肺泡表面张力、促进肺气体交换、参与肺防御功能等作用。SP-D是其中的一种水溶性蛋白，与机体的免疫功能和炎症调节息息相关，存于全身多处黏膜表面。与SP-A相比，SP-D与急性加重期频率的相关性更好[55]，SP-D的水平与疾病诊断的准确性相关[56]。但是目前尚无充足的数据证实其与RA-ILD发生发展的关系。

3.5基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) MMPs属于锌依赖的蛋白酶家族，与细胞外基质息息相关，是一类能降解组织和细胞膜结构的蛋白[57-58]。MMP-7主要由黏膜上皮细胞、角质细胞、巨噬细胞等分泌，在皮肤、肺等多种组织中表达。细胞外基质与MMPs间存在动态平衡，当平衡被打破时，细胞外基质异常增多导致细胞结构重建和肺纤维化形成。动物实验证实，MMP-7基因敲除小鼠能够避免博来霉素诱导的纤维化形成[59]。Rosas等[60]研究发现，与正常对照者相比，特发性PIF患者的血清、血浆、肺泡灌洗液及肺组织中的MMP-7水平明显升高，提示MMP-7可能是RA-ILD的生物标志物之一。

3.6涎液化糖链抗原-6(Krebs von den Lungen-6，KL-6) KL-6是一种糖类蛋白，可反映肺泡上皮等组织的损伤情况，是一类具有诊断价值的RA-ILD的血清学标志物。肺部基膜损害可导致血管通透性增加，最终导致KL-6进入血液。血清KL-6水平可反映肺泡的损伤程度以及肺泡上皮和肺间质的损伤程度[61]。ILD患者血清KL-6水平升高[62]。此外，KL-6可诱导成纤维细胞分化，并促使Ⅱ型肺泡细胞分泌增加，这种变化可用于检测RA-ILD的发生、发展及变化。

3.7抗瓜氨酸热激蛋白90 热激蛋白90是一类热应激蛋白，当机体处于高温时，热激蛋白90合成以保护机体。热激蛋白具有分子伴侣活性，可帮助氨基酸链折叠成正确的三维结构，清除受损的氨基酸链等。有研究表明，抗瓜氨酸热激蛋白90诱导的细胞因子反应可以区分RA患者和RA-ILD患者，其灵敏度适中(约30%)，特异度高(>90%)，提示抗瓜氨酸热激蛋白90可能是一种预测RA-ILD的生物标志物[63]。

4 小 结

近年来，关于RA-ILD生物标志物的研究已经取得了重大进展，KL-6、SP-D等相关生物标志物已在RA-ILD的预测、早期诊断、疾病活动度、预后及评估等方面发挥了一定作用。目前，关于抗瓜氨酸热激蛋白90、PAD-4等生物标志物的研究仍较少，且在疾病相关程度、特异性和敏感性上仍存在争议，大部分研究仍然缺乏关于相关生物分子与疾病活动度的动态监测，且临床意义有限，需要大样本、多中心研究的进一步验证。在今后的研究工作中，需要对上述生物分子进行深入探究，以提高疾病诊治的准确度，从而早期诊断及治疗RA-ILD，改善患者生活质量及预后。