垂体泌乳素腺瘤的动物模型和发病机制研究进展

王雄，马莉，吴金虎

(武汉大学附属同仁医院 武汉市第三医院药学部，武汉 430060)

垂体瘤是常见的颅内肿瘤，占颅内肿瘤发病率的15%，泌乳素腺瘤是最易发生的垂体瘤，在各种类型的垂体肿瘤中，泌乳素腺瘤的所占比例高达67%[1]。泌乳素腺瘤是发生于垂体前叶的泌乳素上皮细胞肿瘤，是由泌乳素细胞瘤分泌过量泌乳素而导致的神经内分泌相关疾病。根据肿瘤的大小，可分为微腺瘤(直径<1 cm)、大腺瘤(直径为1～3 cm)和巨大腺瘤(直径>3 cm)；按其侵袭性，有侵袭性腺瘤和非侵袭性腺瘤之分。泌乳素腺瘤典型的临床表现为：女性闭经、溢乳、高泌乳素血症、不育等；男性乳房发育、性功能减退、阳痿等；另外，侵袭性的肿瘤还会侵犯周围神经结构和组织而引起其他的症状和病变。目前，国内治疗药物仅有溴隐亭一种，溴隐亭治疗效果显著，但价格昂贵，且存在一定的不良反应(如胃肠道反应)，剂量较大时可有眩晕、直立性低血压、头痛、瞌睡及便秘等；20%的泌乳素腺瘤患者经溴隐亭治疗后出现耐药现象，对溴隐亭耐药或对其不良反应不耐受的患者，尚无替代治疗药物[2-3]。近年来，垂体泌乳素腺瘤的研究取得了一定进展，但其发病机制目前尚不完全清楚，同时临床治疗药物也有限。现就垂体泌乳素腺瘤动物模型和发病机制的研究进展予以综述。

1 垂体泌乳素腺瘤的动物模型

1.1雌激素诱发垂体瘤模型 雌激素诱发垂体瘤是目前最常用的垂体泌乳素腺瘤造模方法，造模时间较短，费用较低，模型稳定可靠。切除雌性大鼠卵巢后，通过摄入外源性雌激素使垂体泌乳素腺瘤生长，此模型与人类泌乳素腺瘤高度相似，便于探索疾病的发病机制。雌激素诱发垂体瘤模型使用的大鼠品系主要有F344(fischer 344)[3]大鼠和Wister(wistar-furth)[4]大鼠，BN(brown norway)大鼠和Holtzman大鼠难以通过此方法成功造模[5]，主要原因可能是不同品系大鼠对雌激素敏感性存在一定的差异。其中，给予雌激素诱导几周后，F344大鼠腺体异常增长，血清泌乳素水平也显著增高[3]。F344品系大鼠对雌激素敏感，造模周期较短，模型较稳定，一般情况下选择此品系大鼠进行造模。

1.2转基因动物垂体瘤模型 近年来，随着分子生物学的迅速发展，对泌乳素腺瘤的分子生物学研究也逐渐深入。研究发现，内分泌类肿瘤形成的根本原因可能是基因突变的结果[6]，垂体泌乳素腺瘤的形成与许多基因的调控相关[7]。目前开发的转基因模型制备方法是利用CRISPR/Cas系统将小鼠的某个基因敲除或将某个基因敲入特定的DNA区域，然后通过直接显微注射获得目标模型动物[8-9]。这是目前基因工程应用中的一种最简便、可靠、高效的造模方法，在特定基因对肿瘤影响的研究中十分有效。Seruggia和Montoliu[10]研究证实，多巴胺D2基因敲除小鼠可用于制备稳定可靠的泌乳素腺瘤模型。Recouvreux等[11]通过用胚胎干细胞中D2基因靶向诱导雌性Drd2-/-小鼠，然后与野生型的雄性小鼠交配来进行扩繁，通过对小鼠的基因组DNA进行聚合酶链反应来鉴定 Drd2+/+、杂合子和Drd2-/-的小鼠，这种模型通常在动物在8月龄时使用，此时Drd2-/-雌性小鼠垂体增生，腺瘤形成。

1.3可移植性垂体瘤模型 近年来，可移植性肿瘤模型的发展越来越成熟。目前，可移植垂体瘤模型按移植部位主要分为皮下移植、肾囊内移植和颅内移植3类[2]。主要是将供体肿瘤组织或经原代培养的肿瘤细胞移植到受体体内，并保证肿瘤正常生长。可移植性肿瘤模型受体无需雌激素诱导，肿瘤可在受体内生长迅速，便于实验观察分析。Missale等[12-13]成功将人类泌乳素腺瘤细胞移植到裸鼠皮下，但未进行后续稳定性研究。可移植性肿瘤模型与人类泌乳素腺瘤有一定的差别，且并非所有雌激素诱发的垂体瘤都有可移植性[13]，故仍需探索更加优良的可移植瘤模型。

1.4自发性垂体瘤模型 动物自发性垂体瘤与人类泌乳素腺瘤较相似，但发生率较低，造模周期较长。研究发现，一些小鼠(C3H)和大鼠(SD)可产生自发性垂体瘤，Wistar大鼠也可产生自发性垂体瘤，但存在性别和年龄差异，雌性较雄性大鼠肿瘤发生率高，年龄越大肿瘤的发生率越高，但总体发生率较低，50周龄以下Wistar大鼠几乎不发病[14]。其他品系大鼠自发垂体瘤的发生率很低，F344大鼠自发性垂体瘤发生率为20.5%，CD-1大鼠的发生率为1.1%[15-16]。故自发性垂体肿瘤模型虽具有一定优势，但构建周期较长，垂体瘤发生率较低，且不便观察，目前较少应用。

2 垂体泌乳素腺瘤的发病机制

泌乳素腺瘤发生于垂体前叶，垂体前叶整合了控制甲状腺、肾上腺等生殖和生长功能的激素信号通路。垂体通过促进激素分泌调控内环境的稳态，但所获得的垂体信号也会引起塑形的垂体生长反应，包括功能性垂体细胞发育不良、过度增生和腺瘤形成等[17]。目前泌乳素腺瘤的发病机制尚不完全清楚，主要有几种理论假设，包括雌激素/受体机制、基因的异常表达以及细胞因子、受体和信号通路的异常调节、微RNA(microRNA，miRNA)的调控等。

2.1雌激素/受体机制 雌激素可直接穿越细胞核膜，与相应的核受体结合，形成二聚体作用于靶基因，启动或修饰基因转录，上调相关基因表达。GH3/B6/F10 细胞膜雌激素受体(estrogen receptor，ER)丰富，给予10 nmol/L雌激素则细胞内钙离子水平增加；1 pmol/L和1 nmol/L雌激素即可引发细胞中泌乳素的释放，且雌二醇和己烯雌酚尚能够激活胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及与ERKs激活相关的通路[ER、表皮生长因子受体、膜组织化、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、Src激酶][18]。

2.2基因的异常表达 环境因素和遗传因素共同导致肿瘤的发生，其中基因的异常表达与人类肿瘤的发生息息相关。在细胞的生长增殖中，原癌基因和抑癌基因的调控非常重要。

2.2.1与泌乳素腺瘤相关的原癌基因 癌基因活化使细胞发生数量或结构上的变化，导致细胞癌变，主要活化途径有获得启动子与增强子、染色体异位、基因扩增和点突变。实验证明，垂体瘤转化基因 (pituitary tumor-transforming gene，PTTG)在大鼠正常垂体组织中不表达，但在雌激素成功诱导大鼠泌乳素腺瘤中高表达，并在体外培养的泌乳素腺瘤细胞中高表达，表明异常表达PTTG基因与泌乳素腺瘤的产生有较大的相关性[3]。并且，功能性人类泌乳素腺瘤也表达PTTG[19]，意味着人类泌乳素腺瘤中也存在特异性表达的原癌基因。

目前与PTTG基因相关的泌乳素腺瘤发生机制有以下推测：①PTTG与myc家族的c-myc癌基因启动子结合后激活，从而使细胞无限增殖导致肿瘤的产生[18]；②PTTG基因可诱导成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)的分泌，FGF可促进肿瘤血管的形成，进而导致肿瘤发生[20-21]；③PTTG基因调控区发生点突变使其表达水平异常，从而导致细胞增殖等一系列变化[22-23]。

2.2.2与泌乳素腺瘤相关的抑癌基因 抑癌基因也称为肿瘤抑制基因，这类基因发生突变、缺失或失活时会导致肿瘤的发生。Zhou等[24]研究表明，与垂体肿瘤有关的多种肿瘤抑制基因可基于它们与肿瘤抑制基因Rb或p53的相互作用而被分成p53组和Rb组；p53蛋白质是一种转录因子，由p53基因编码形成，控制细胞周期的启动，若其失活或突变，将引起细胞的不断增殖而形成肿瘤，而p53组与泌乳素腺瘤相关的抑癌基因包括MEG3(maternally expressed 3)、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、多型性腺瘤基因样蛋白1、Ras相关区域家族1基因、Ras相关区域家族3基因和细胞因子信号抑制分子1。Rb是视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白，由Rb基因编码形成，Rb基因是人类克隆成功的第一个抗癌基因；Rb组与泌乳素腺瘤相关的抑癌基因包括细胞周期依赖性激酶抑制基因2A、细胞周期依赖性激酶抑制基因2B、细胞周期依赖性激酶抑制基因2C、视网膜母细胞瘤基因1、骨形态发生蛋白4、钙黏蛋白1、钙黏蛋白13、生长停滞和DNA损伤可诱导蛋白β、生长停滞和DNA损伤可诱导蛋白45g、芳烃受体相互作用蛋白和多发性内分泌腺瘤致病因子1(multiple endocrine neoplasia 1，MEN1)等[23]。其中p53组肿瘤抑制基因MEG3在垂体中发挥着重要的作用，Chunharojrith等[25]研究发现，p53的灭活完全消除了MEG3的肿瘤抑制，表明MEG3肿瘤抑制由p53介导。Rb组的MEN1基因也是一种与泌乳素腺瘤相关的肿瘤抑制基因，该基因编码蛋白质menin，Walls等[26]研究表明，MEN1基因过表达在体外抑制了细胞增殖。

2.2.3垂体特异性转录因子1(pituitary specific transcription factor，Pit-1) Pit-1是垂体中转录因子 POU homeodomain家族成员，是3种垂体前叶细胞(即亲躯体细胞、泌乳素细胞以及甲状腺激素释放激素细胞)正常生长所必需的，对生长激素(growth hormone，GH)、泌乳素、甲状腺刺激素亚基的表达以及甲状腺激素受体、GH释放激素受体和 Pit-1自身表达均十分必要；实时荧光定量聚合酶链反应显示，人泌乳素腺瘤中 Pit-1的表达增高[27]。大鼠Pit-1蛋白由273个氨基酸组成，包含N端转录激活区和POU区，N端转录激活区负责Pit-1蛋白对于靶基因的转录激活，POU区由POU特异区和POU源区组成，负责与靶基因的特异性结合；雌激素通过上调其受体和刺激Pit-1基因表达来增强泌乳素基因表达，诱发促性腺激素细胞转化为泌乳素细胞，致大鼠泌乳素细胞中泌乳素表达增高以及高泌乳素血症[28]。

在体内条件下，存在依赖雌激素的ER与Pit-1蛋白的物理结合，且这种相互作用在调控泌乳素基因表达中发挥着重要作用。在泌乳素垂体瘤细胞中，蛋白质合成抑制剂放线菌酮可阻断复合物合成，减少雌激素激活的泌乳素基因表达，表明辅助蛋白因子参与了ER-Pit-1复合物形成及随后的促泌乳素基因激活[29]。

2.3细胞因子调节 细胞因子被分为生长因子、炎症因子、肿瘤坏死因子等。体内的这些细胞因子通过各种自分泌或旁分泌的方式发挥作用，对人体生理功能产生重要的调节作用。研究发现，与泌乳素腺瘤相关的生长因子有很多，FGF与血管生成相关，其中FGF-2及FGF-4均在泌乳素阳性垂体腺瘤中被发现；血管内皮生长因子在侵袭性泌乳素腺瘤中高水平表达，可能与肿瘤新生血管有关[19]。PTTG可以促进FGF和血管内皮生长因子的表达而诱导肿瘤血管的形成[20]。骨形态发生蛋白4是转化生长因子-β家族成员之一。研究表明，骨形态发生蛋白 4在雌激素诱发大鼠垂体泌乳素腺瘤及人类垂体泌乳素腺瘤中均过度表达，并可通过与ER的相互作用促进泌乳素分泌及泌乳素细胞增殖[30]。

2.4受体调控机制 多巴胺D2受体敲除的小鼠可形成泌乳素腺瘤，但具体的发病机制尚不明确[10]。多巴胺受体是含7个跨膜区域的G蛋白偶联受体家族，可将胞外刺激转导入细胞内。G蛋白的调节亚基Gαi可抑制腺苷酸环化酶，使环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)产生减少，进而使蛋白激酶A减少，蛋白激酶A可催化cAMP应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)丝氨酸残基磷酸化，从而激活Pit-1[31]。而Pit-1是GH和泌乳素表达所必需的转录因子，Pit-1的启动子包括1个Pit-1结合位点和2个CREB结合位点[32-34]。因此，CREB磷酸化水平的改变可使GH和泌乳素基因的转录水平发生变化，进而导致泌乳素生成增加。

2.5细胞信号通路调控机制 目前与泌乳素腺瘤发生相关的信号通路包括：PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路或Ras/ERK信号通路的持续激活，能使敏感的细胞转化为肿瘤细胞。有研究通过泌乳素腺瘤与正常垂体组织比较发现，垂体泌乳素腺瘤细胞中PI3K/Akt信号通路在最初的级联反应中被上调，PI3K/Akt和Ras/ERK信号通路通过酪氨酸激酶受体被激活，导致细胞周期抑制蛋白失活，从而导致细胞过度增殖，而信号通路的异常和通路之间的相互作用可能在垂体泌乳素腺瘤发生的初始阶段发挥重要作用[35]；Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路，氟维司群是一种ER拮抗剂，可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制垂体瘤MMQ细胞的增殖和泌乳素的分泌[36]。

2.6miRNA的调控机制 miRNA是一类非编码RNA，在转录后可调节大量基因的表达，在许多细胞过程中起着重要的作用。目前，在肿瘤的研究中对肿瘤所涉及的miRNA的研究十分重视，也取得了很多重大的进展。对垂体泌乳素腺瘤相关的miRNA的探索也取得了一定成就，它将作为一种新型的生物标志物用于疾病的检测和治疗。Bottoni等[37]发现，在泌乳素腺瘤中miR-15a和miR-16-1的表达显著下调。之后，对于miRNA的研究逐渐深入，研究证实，垂体腺瘤中表达上调的miRNA有miR-23a、miR-107、miR-150、miR-152、miR-191、miR-192和miR-212[38]以及 miR-26a和miR-26b[39]；表达下调的主要有miR-23b、miR-130b、miR-34b、miR-570、miR-603、miR-128a、miR-132、miR-24、miR-98、miR-143、miR-145和let-7[34]。miRNA通过其特定的靶基因来调控机体的反应。目前对于miRNA具体调控哪些靶基因的表达虽有一定的基础研究，但具体机制尚不明确，需继续深入探索。

3 小 结

垂体泌乳素腺瘤对人类生殖健康产生了极大的危害，经过国内外学者多年的探索，垂体泌乳素腺瘤的研究取得了很多进展。目前垂体泌乳素腺瘤的动物模型制作方法均不够完善。泌乳素腺瘤发病机制的研究已发展到细胞和分子水平，存在多种理论假说，但仍需进一步的研究来阐明其确切的发病机制。因此，急需研发出更精准的泌乳素腺瘤动物模型，深入开展泌乳素腺瘤发病机制的研究，为后期垂体泌乳素腺瘤的治疗和临床药物研发提供依据。