蛋白亲环素D基因功能研究进展

胡威，祝恒成，李浩勇，刘修恒，曾艳

(武汉大学人民医院泌尿外科，武汉 430060)

蛋白亲环素D(cyclophilin D，CypD)是由顺-反异构酶F基因编码的线粒体基质蛋白，为一种肽基脯氨酰异构酶和可溶性蛋白，是线粒体亲环蛋白基因家族的成员[1]，CypD由两层膜包被，直径 0.5～1.0 μm，为纺锤状或棒状，需使用电子显微镜识别。线粒体是细胞中制造能量的结构，同时是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为细胞的发动机，与细胞内钙离子(Ca2+)平衡相关。关于线粒体早期的研究主要涉及细胞凋亡，线粒体内膜外侧的外周蛋白细胞色素C能介导细胞凋亡，而细胞色素C为可溶性蛋白，易于获得结晶，且研究方法较简单方便，因此细胞色素C是目前研究较透彻的凋亡基因。随着研究的深入，人们发现线粒体与“坏死”——细胞死亡的另外一种途径密不可分，其中涉及线粒体的另一个重要结构，即线粒体通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)，而CypD是MPTP的调控开关[2]。CypD结合于MPTP的腺苷酸转位子上，是一种肽基脯氨酰异构酶，定位于10q22～10q23，信使RNA全长2 213个碱基，编码207个氨基酸[3]。目前国内外关于CypD功能的研究已开展20余年，对CypD的功能已有了比较详细和全面的认识，现就CypD基因功能的研究进展予以综述。

1 CypD与缺血再灌注损伤

早在2005年，两个独立的研究小组使用当时最先进的基因敲除技术，将实验小鼠的CypD基因敲除，得到的CypD基因敲除小鼠对心脏的缺血再灌注损伤有显著的抵抗作用，且得到的CypD基因敲除小鼠未表现其他生理和病理异常，该研究成果发表于同年3月的《Nature》杂志，并得到了线粒体研究领域权威专家Halestrap教授的认可；同时，研究人员从CypD基因敲除小鼠的心、肝、脑等重要器官中分离出线粒体，电子显微镜下发现这些线粒体在形态上完全无异常表现，但对过量Ca2+导致的线粒体肿胀和通透性转换具有了抵抗作用[4-5]。此后，有研究表明，CypD基因敲除对缺氧诱导的正常大鼠肾细胞坏死途径的细胞死亡有抵抗作用；此外，通过慢病毒载体等分子生物学技术下调CypD的表达对大鼠肾缺血再灌注损伤具有保护作用[6-7]。而下调CypD的表达在心、脑、肺等重要器官缺血再灌注损伤中的保护作用也得到了验证，2005年前的研究提示，CypD可能是通过调节腺苷酸转位子的功能，抑制细胞凋亡，从而发挥作用[4-5，7-12]，即细胞凋亡→细胞死亡通路；2005年后，关于CypD基因的作用机制逐渐清晰起来，CypD的过表达能直接促进线粒体MPTP的开放，从而导致线粒体通透性的转变，线粒体的通透性增加后，细胞对外界刺激诱导细胞坏死的敏感性将增加，常见的外界刺激有一氧化氮和一些化疗药物等[6，13-20]。而常用的凋亡诱导剂羰基氰化物间氯苯腙在该过程中却没有任何作用，甚至还产生了抑制，说明细胞坏死过程与CypD诱导的线粒体通透性改变有密切关系[17-20]。此外，虽然CypD基因敲除的小鼠在发育上无异常，但体外实验表明，正常小鼠和CypD基因敲除小鼠的CypD基因在细胞水平的差异有统计学意义；且由于CypD基因已被敲除，环孢菌素A(cyclosporin A，CsA)对CypD基因敲除小鼠无效[21-23]。但却对活性氧类及Ca2+超载诱导的细胞坏死产生了抵抗，细胞坏死过程受到抑制后减慢，而细胞凋亡的过程却无异常变化[24-27]。

此外，动物实验发现，CypD基因敲除小鼠能抵抗缺血再灌注诱导的心肌损伤，减少心肌坏死；反过来，用慢病毒过表达载体将转基因小鼠的CypD基因过表达，实验动物则会出现心肌肥大并伴有心肌细胞功能下降，体外实验观察到心肌细胞坏死增加，并伴有线粒体的异常肿胀[9]。在大鼠肾缺血再灌注损伤模型中，通过小干扰RNA或慢病毒载体下调CypD基因表达能对大鼠肾缺血再灌注损伤产生抵抗[6]。结合以上这些数据得出结论：CypD诱导的线粒体通透性转变不再单纯的是细胞色素C通路介导的细胞凋亡，还介导了一种调节性坏死，即Ca2+超载和氧化损伤等外界因素诱导的细胞坏死[28-29]。

2 CypD与氧化应激

氧化应激的定义是指体内氧化与抗氧化两者失衡，氧化强于抗氧化，机体倾向于被氧化，体内高活性分子(如活性氮自由基与活性氧自由基)产生过多，氧化程度超出了氧化物的清除速度，从而导致组织损伤[30-31]。近年来，研究人员对抗氧化治疗的研究取得新进展，提出了“氧化应激干扰”的新观点[32]。氧化应激干扰是指机体在健康或亚健康状态时，体内老化的旧细胞及已发生变异的细胞(如肿瘤细胞)通过氧化应激被清除掉，并排出体外，这样机体的内环境才能保持平衡，并维持在一种有序、健康的状态，此时氧化应激的作用是积极、正面的，相当于机体的自我修复过程[33-34]。也可以这样讲，氧化应激是一种生物体的自我保护及自我更新的有效手段，这是生物体经过长期发展、进化及自然选择所获得的。

但是，如果生物体内的这种正常秩序被一种或多种原因破坏，比如，当外源物(如细菌、病毒等微生物)侵入时，生物体的第一反应往往是启动异源物代谢，此时产生大量的活性氧自由基，氧化应激随即启动，将侵入的微生物过氧化，从而杀死并清除这些外源物[35]。此过程一般都会使机体产生过量的活性氧类及其副产物，暂时处于窗口期，如外源物过多，超出氧化应激清除能力，就会产生过量的活性氧类，过量的活性氧类对机体有害，它会产生大量变性蛋白质及脂质等，会造成循环异常，并同时诱导代谢，甚至改变基因表达，造成机体相关功能异常，导致机体内处于进一步无序的状态[36]。

当生物体氧化剂和抗氧化剂不平衡时，氧化应激水平会大幅升高，在窗口期内，仅处于量变阶段，不会造成器质性的病变，生物体也不会有任何异常表现，即“亚健康”状态，当氧化和氧化剂继续失衡，超出了氧化应激窗口期后，生物体将会出现器质性病变[33-36]，即病理状态。研究表明，氧化应激窗口期依然涉及Ca2+内稳态及线粒体通透性转化等关键步骤，CypD基因作为线粒体MPTP的开关及线粒体的重要组成部分起着重要作用，在体外实验中，随着氧化应激强度的增加或作用时间延长，正常人类肾小管上皮细胞坏死明显增加[36]。应用小干扰RNA直接下调细胞CypD基因的表达，或使用CypD抑制剂CsA均能有效减少氧化应激对正常人肾小管上皮细胞的损伤，而氧化应激诱发人肾小管上皮细胞的坏死过程依赖于CypD[28-29，35]。此外，研究人员发现，缺血组织发生再灌注时，组织同时也会产生大量的过氧化氢，过量的过氧化氢反过来会介导氧化应激，导致细胞损伤及死亡，将组织损伤的过程加速，这说明缺血再灌注损伤和氧化应激两者之间有着某种联系，可以相互促进，导致组织损伤加重，细胞迅速坏死[26，29]。但CypD在氧化应激窗口期发挥的作用，具体机制目前并未完全研究清楚，它具体是仅通过线粒体途径调控细胞坏死来发挥作用，还是直接通过抗氧化来逆转组织的过氧化状态，或是以上两种作用兼而有之，还需进一步研究证实[36]。

3 CypD与肿瘤的关系

关于CypD基因功能的研究，早期仅局限于缺血再灌注损伤及氧化应激等生理过程，仅认为CypD主要通过调节MPTP通透性或腺苷酸转位子的功能来发挥调节细胞坏死或细胞凋亡的作用[19，21]。随着对CypD基因功能研究的深入，CypD与肿瘤的关系逐渐成为最近5年研究的热点，但并未发现小鼠器官出现肿瘤改变，仅为心肌细胞中的线粒体的异常膨胀[37-38]。进一步研究表明，CypD基因的表达在人类肾癌、肝癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌细胞中均出现了特异性的改变，主要机制目前有如下几种解释：①从分子生物学角度理解，肿瘤本质是细胞的过度增殖，早期研究表明，CypD可通过下调细胞凋亡而促使肿瘤的发生，主要还是通过调控MPTP的开放，通过调节Ca2+通道介导的激活来调节凋亡，此过程中细胞器内相关的离子平衡会打破，导致细胞器肿胀，进而导致细胞外膜破裂和线粒体释放促凋亡因子，从而控制细胞死亡过程，导致细胞过度增殖，导致肿瘤发生发展，在整个过程中CypD调节MPTP的开放是一个重要的步骤[5-6]。②随着研究的继续深入，研究人员发现，CypD导致线粒体功能改变时，将协同刺激产生活性氧自由基，并激活c-Jun 氨基端激酶信号转导通路，而c-Jun氨基端激酶能配合致癌基因Ras抑制 Hippo信号转导通路，导致致癌基因上调，促进肿瘤的发展[37-38]。另外，有研究者发现了一个新的介导肿瘤细胞死亡的机制(不同于通过单纯的调节CypD的表达导致MPTP开放)，即某些基因(如哺乳动物不育系20样激酶1)可通过与CypD结合形成大分子蛋白复合物直接改变MPTP的结构，研究人员用化疗药物吉西他滨刺激哺乳动物不育系20样激酶1基因，哺乳动物不育系20样激酶1与CypD组成的大蛋白复合物在线粒体上被检测到；同时，使用CypD抑制剂CsA阻止大蛋白复合物的形成，可以抑制吉西他滨诱导的细胞死亡，表明CypD基因可能决定吉西他滨的耐药[38-39]。③还有研究表明了CypD是同时通过下调细胞凋亡和调节细胞坏死两组途径来促使肿瘤发生的，且主要是通过胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路来发挥作用[40-46]。CypD诱导的肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)组织细胞坏死和凋亡均过度表达，CypD蛋白的下调抑制了肾癌细胞的凋亡及坏死，促进了细胞周期蛋白的发展，导致细胞过度增殖[44]。基于CypD对MPTP开放的调控作用，CypD过表达诱导线粒体膜电位去极化。提示CypD表达下调抑制了MPTP的开放，促进了ccRCC的发展。

来自人类ccRCC组织标本的主要免疫组织化学数据显示，与癌旁组织相比，ccRCC中的CypD蛋白表达显著降低，并且观察到CypD表达与肿瘤分期、大小及淋巴结转移之间的相关性，表明CypD表达与ccRCC的发展呈负相关[44]。细胞系中CypD的表达也下调。研究表明，索拉非尼(治疗转移性ccRCC的二线药物)能上调肾癌细胞中CypD的表达，同时对体外培养的ccRCC细胞株具有抑制增殖、诱导凋亡和线粒体膜电位去极化的作用[44]。CypD抑制剂(CsA)和小干扰RNA-CypD逆转了索拉非尼对ccRCC细胞增殖、凋亡和线粒体膜电位去极化的影响，表明索拉非尼的抗肿瘤作用与CypD通过线粒体途径诱导细胞凋亡有关[44-45]。来自CypD组织的主要免疫组织化学数据显示，与癌旁组织相比，ccRCC中ERK蛋白表达显著增加，且ERK和CypD的表达呈负相关[44]。体外研究表明，ERK可以负调控CypD的表达，促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2及其下游ERK的去磷酸化介导ccRCC的凋亡[42-45]。这些结论提示，ERK的激活抑制了介导MPTP开放和诱导ccRCC凋亡的CypD的表达，同时pcDNA3.1-ERK (ERK激活物)的过度表达能抑制索拉非尼对CypD表达的刺激作用，从而诱导肾癌细胞凋亡和线粒体膜电位去极化[46-49]。这些结果表明，CypD是通过ERK信号通路途径介导索拉非尼对抗ccRCC的作用，同时也支持CypD是索拉非尼的一个抗癌药物靶点[44-49]。

4 小 结

CypD是细胞器线粒体的重要组成部分，CypD功能的研究大致上经历了三个阶段。第一阶段，认为CypD基因主要是通过干扰细胞凋亡介入线粒体途径的细胞死亡；第二阶段，认为CypD主要是通过线粒体途径的调控性细胞坏死发挥抗氧化应激及器官缺血再灌注损伤等过程，不是简单的调控细胞凋亡；第三阶段：CypD基因功能进一步延伸至多种肿瘤，且CypD基因可通过干扰凋亡及调节性坏死在肿瘤发生发展中发挥作用。同时CypD基因是某些抗癌化疗药物的靶点(吉西他滨、索拉非尼等)。