铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因的研究进展

李 越，鞠晓红，李 瑶，骆晓峰 (吉林医药学院,吉林 吉林 132013)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)，也称为绿脓杆菌，是临床实践中相对多见的一种条件致病菌,现已发展成为院内感染的重要病原菌之一。PA的抗性机制主要是水解酶的生成，超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)的生成是导致超广谱β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因。ESBLs是以将广谱和窄谱头孢菌素、单环类抗生素和盘尼西林等灭活为特征的一种β-内酰胺酶。临床上抗生素的应用越来越多，导致PA对ESBLs耐药的情况呈现出明显上升的趋势。现就PAESBLs耐药基因的分类、流行情况及检测方法进行综述。

1 PA ESBLs耐药基因的分类

PA对超广谱β-内酰胺类药物耐药引起的院内感染是抗菌治疗中最具挑战性的目标之一。经过对PA的不断研究与探索,在其中检测出了多种类型的ESBLs耐药基因。据悉国外已发现150多种基因类型[1]，主要分为GES、OXA、VEB、PER、SHV及其他少见类型，其中在中国以OXA和SHV最为常见。经研究在PA中已经检测出的GES型耐药基因有GES-1、GES-8和GES9等[2]，SHV包括SHV-1、SHV-2、SHV-2a、SHV-5及SHV-12等类型，其他的SHV型耐药基因主要存在于大肠杆菌中[3]，还检测出了PER-1、PER-2、PER-3和VEB-1等类型的耐药基因[4]。并且主要存在于PA中的OXA型耐药基因也被检测出来了，至今OXA型耐药基因已经被分离出58种以上的类型，分别命名为OXA-1～OXA-58，其中发现OXA-2、OXA-10、OXA-11及OXA-17等具有ESBLs活性[5]。对于ESBLs耐药基因国内也在不断对其进行深入的探索，近年来继在一位老年重症患者标本首次中发现了GES-5型后[6],相继发现了OXA30、OXA-48、SHV-11和PER-3等耐药基因型[7]。

1.1 GES型耐药基因

在分子分类中，GES被归为A类酶。它的性质与ESBLs的一般特性相似，通常对盘尼西林、超广谱头孢菌素和氨噻酸单胺菌素类抗生素具有耐药性，对头霉素类抗生素较敏感，其活性可被克拉维酸、三唑巴坦抑制[8]。因为GES蛋白中含有可以自身转移的质粒，其转化的接合子插入到质粒上使细菌对超广谱β-内酰胺类抗生素产生耐药性[9]，使得不一样的基因型对抑制剂的敏感性和底物谱的水解能力存在一些差别[10]。在法国、南非、希腊及土耳其等地由GES引起的院内感染都被多次报道过[11]，通常都是引起爆发式感染。但在国内GES引起的感染比较少见，至今被国内报道的只有GES-1和GES-5，对此国内研究还不是很透彻。

1.2 OXA型耐药基因

OXA主要在PA中检测到，在其他细菌中偶见。OXA在分子分类上归于D类酶，在OXA-10、OXA-2和OXA-1基因中都可以形成OXA型耐药基因。其中以OXA-10的发展为主，它们间的同源性在20%～30%之间，PI值介于5.5～8.1[12]。OXA能够诱导细菌外排泵的高表达，而被诱导的外排泵具有主动外排的机制，能够将进入的药物排出体外，形成耐药机制。因此OXA型ESBLs耐药基因对苯唑青霉素和甲氧西林的水解作用比较强，对于头孢菌素类的水解能力低于盘尼西林类。克拉维酸等抑制剂也不能完全抑制OXA型耐药基因的活性,但是在体外可以被NaCI强烈抑制[13]。OXA最初主要在法国和土耳被检测出[14]，近年来我国也发现并报道了OXA型耐药基因型，其中OXA在PA中的检出率比较高，并对其耐药机制及基因型的分布情况做了初步研究。

1.3 VEB型耐药基因

VEB是一种不是很典型的小型ESBLs耐药基因[15]。它的编码基因主要定位于质粒，并且该质粒同时携带其他多种非β-内酰胺酶抗性基因[16]，诱导PA产生不同的灭活酶、钝化酶和修饰酶,从而形成完整的耐药机制[17]。该酶对头孢噻甲羧亏和氨基曲南有高度的抗性,对克拉维酸具有敏感性,使头孢噻甲羧亏与克拉维酸有明显的协同作用[18]。VEB首次在越南被发现和报告，是在绿脓杆菌中被发现的，随后在东南亚大量的肠杆菌和绿脓杆菌中被发现。VEB在中国比较少见[19]，目前国内正在致力于VEB-1的深入探索。

1.4 PER型耐药基因

在分子分类中，PER被归为A类酶，到目前为止，已发现3种耐药基因型，分别是PER-1、PER-2与PER-3[20]。因为耐药表型与基因型之间有良好的相关性，使得它具有水解氨曲南和氧亚氨基头孢菌素的性质。并且PER型耐药基因的活性可以被克拉维酸抑制剂所抑制,但其对EDTA和与氯唑西林并非特别敏感，对头孢他啶有高度的耐药性,对哌拉西林-三唑巴坦在一定程度上也有抗药性[21]。目前，国内外对PER的研究报道都不是很多，对其引起的感染严重程度及传播范围也不是很清楚。

1.5 SHV型耐药基因

SHV型是较早发现的酶型之一[22],它的结构基因发生突变导致酶的催化腔变大，无法阻止第三代头孢菌素入酶体而被水解，使酶对第三代头孢菌素的亲和力被大大提高，从而扩大了SHV酶的耐药谱，使临床抗感染救治变的很艰巨，并在世界各地已经引起了高度重视[23]。在分子分类中SHV被归为A类酶。现发现SHV的种类已经有一百多种了，SHV型ESBLs抗性基因的PI在7.0～8.2之间，固呈碱性[24]。SHV不能水解苯唑西林、广谱头孢菌素和头霉素，但是水解氨苄西林的能力非常强，它还能够高效地水解窄谱头孢菌素与青霉素[25]。近年来SHV的研究已经成为热潮，国内外相关报道明显增多了不少，而中国报道最多的是SHV-12。

1.6 其他少见类型基因

除了GES、OXA、VEB、PER、SHV型耐药基因外还有BEL、OXY、OKP、PSE等少见类型。因为不确定它们的流行范围，检出率极低，国内外对其的研究也特别少。因此关于这些少见基因型的研究还有很大的上升空间。

2 PA ESBLs耐药基因的流行病学情况

1998年于法国圭亚那地区首次发GES型ESBLs耐药基因之后就陆续被其他国家所发现，并且分离出GES-1、GES-2、GES-3及GES亚型等多种类型[26]。关于GES的流行病学情况在法国、南非、希腊等被多次报道过，通常都是由GES引起的爆发式院内感染[27]。国外文献曾报道OXA型ESBLs耐药基因主要存在于绿脓杆菌中，传播途径广泛，传播能力强。OXA的许多类型最初是在法国和土耳其被发现的，北非曾报道了由OXA-18引起了医院感染的暴发流行[28]，目前GES和OXA型主要地理分布情况还不是特别明确。继在越南发现绿脓杆菌中的VEB-1后，2001年9月,蒋晓飞等在上海瑞金医院烧伤科重症监护室检测到绿脓杆菌中的VEB-1型耐药基因，这是中国首次有VEB的报道。2003年，骆俊在华山医院的阴沟肠杆菌中发现了VEB型耐药基因[29]，VEB在国内还没有被报道引起院内感染。PER-1型耐药基因首次被发现是在法国，也是在PA中被检测到。PER-2在阿根廷沙门菌分离株中以及玻利维亚的PA分离株中被依次检测出来[30]。1974年Matth首次发现了于TEM相似的SHV-1，之后相继分离出了SHV-2、SHV-3、SHV-4及SHV-7等一百多种基因型。SHV型耐药基因相对其他类型的耐药基因分布比较广泛，在中国、法国、美国、韩国、意大利、日本及非洲北部的阿尔及利亚等许多国家都有关于其引起院内感染的报道[31]。全世界流行的耐药基因类型各不相同，在中国以SHV-12为主。近年来，PA ESBLs抗性基因引起的院内感染逐渐增多，主要发生在有代谢性疾病、血液病、脓肿的患者及重症患者术后抵抗力低下的人群中。然而治疗情况却没有特别好，国内外关于它的报道在逐渐增多，也在研究控制的方法，院方应对此也给予高度重视。

3 PA ESBLs耐药基因的检测方法

PA ESBLs耐药基因的检测方法分为微生物学检测法和分子生物学检测法。微生物检测法包括①药敏纸片扩散法：选取所需的药敏纸片，用标准纸片扩散法对涂有该菌液的MH琼脂平板进行检测，通过测量抑菌环直径来确定基因类型；②E-test试验：将药物分别置于试纸条两端，贴于涂好菌液的带有刻度的平板上，进行培养，通过读取试纸条两端对应的刻度值确定所检测的基因类型；③三维检测法：该试验是在纸片法的基础上进行改良而形成的，将待测的菌液涂布在MH琼脂平板上，在距离药敏纸片3 mm的位置挖一个环形裂隙，吸取109～1010CFU/mL的菌液，加入裂缝中，菌液不能溢，进行培养，细菌生长过程中产生的水解酶会扩散开来，经过培养后分析所检测的基因型;④自动化仪器法：通过相应的检测仪器来检测基因型。然而这些方法受温度，湿度，酸碱度，培养环境等外部影响因素太多，导致检测结果不是很准确。分子生物学检测法包括聚合酶链反应(PCR)和PCR-单链构象多态性检测,这些方法都是从基因的相关水平上进行检测的，不易检错，外部影响因素少，因此特异性和灵敏度都非常的高，结果也更为准确。

由于超广谱类抗生素使用的越来越多，使得ESBLs耐药基因的耐药性越来越强。目前，法国、美国等国耐药基因的研究比较多并且不断地有新的基因型被发现。国内主要致力于SHV及OXA型耐药基因的研究及院内感染的控制。针对这两种基因型我国研制出了克拉维酸等抑制剂，但是没有显著效果。因此对于ESBLs耐药基因引起感染的控制已经成为目前首要的研究任务。