MORTM1-TAT对吗啡诱导的大鼠小胶质细胞M1型激活状态的影响

郝凤栖 梁永新 范中元 屠后安 张冰 夏婧 褚海辰

(青岛大学附属医院麻醉科,山东 青岛 266003)

长期应用阿片类药物导致的抗伤害性耐受是疼痛诊疗中的重要问题。小胶质细胞激活引起的神经炎症参与了抗伤害性耐受的形成[1]。小胶质细胞的激活状态有M1经典激活状态和M2替代激活状态，M1型激活状态主要释放促炎因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1β)等，并参与吗啡耐受的形成[2-4]。研究小胶质细胞M1型激活状态有利于进一步了解吗啡耐受形成机制。阿片类药物作用的主要靶点有μ阿片受体(MOR)、δ阿片受体(DOR)及κ阿片受体。MOR与DOR广泛分布于中枢神经系统以及外周组织，能调节多种生理效应。研究表明MOR与DOR结合产生的异聚体参与了吗啡耐受的形成[3]。μ/δ阿片受体异聚体干扰肽(MORTM1-TAT)是一种人工合成的μ/δ阿片受体异聚体(MDOR)干扰剂[4]。脊髓小胶质细胞促炎M1型活化状态及促炎因子的释放可能与吗啡耐受发展机制相关。MDOR参与调控痛觉缺失，我们前期预实验提示其与吗啡耐受过程存在关联。本研究提取大鼠小胶质细胞，初步探讨在吗啡的刺激下，MDOR在体外调节小胶质细胞M1型激活状态及促炎因子TNF-α、IL-1β表达中的作用，为防治吗啡耐受提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

MORTM1-TAT(美国MedChemexpress公司)；CD86一抗(德国Sigma-aldrich公司)；μ阿片受体一抗(美国Abcam公司)；δ阿片受体一抗(美国Abnova公司)；GAPDH兔抗大鼠一抗(Elabscience公司)；羊抗兔二抗(德国Sigma-aldrich公司)；TNF-α ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司)。

1.2 大鼠小胶质细胞的提取与培养

从出生1～2 d的Wistar大鼠中取出新鲜脊髓组织，置于4 mL冰冷的Hanks平衡盐溶液中研磨，然后以1 000 r/min离心10 min分离原代细胞。将细胞置于含有100 kU/L青霉素和0.1 g/L链霉素的DMEM培养基中，放置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2恒温饱和湿度培养箱中培养，取状态稳定的对数期细胞用于后续实验。

1.3 分组及处理

将细胞悬液以5×107/L的密度接种于6孔板中，待细胞融合度约60%时，采用随机数字表法分为对照组(A组)、溶剂组(B组)、吗啡组(C组)、吗啡+MORTM1-TAT组(D组)4组。A组细胞加入50 μL DMEM培养基进行孵育，B组加入等剂量PBS溶剂进行孵育，C组加入终浓度为100 μmol/L的吗啡进行孵育，D组加入8 μmol/L MORTM1-TAT孵育2 h后加入终浓度为100 μmol/L吗啡进行孵育，72 h后进行相关指标的检测。

1.4 ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β的表达

孵育完毕后收集细胞上清液，置于-20 ℃冰箱低温保存。以ELISA法检测各组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β的表达情况，具体操作步骤严格依照TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒说明书要求进行。

1.5 细胞免疫荧光技术检测细胞M1表型标志物CD86、MDOR的表达

孵育后使用多聚甲醛固定细胞，30 min后，使用0.01 mol/L PBS漂洗5 min，共3次；随后加入由PBS配制的Triton X-100，以0.01 mol/L PBS漂洗以后，使用体积分数0.05的正常羊血清室温封闭60 min；甩去多余的封闭液，加合适浓度的一抗(分别为CD86抗体、MOR抗体、DOR抗体)，4 ℃冰箱过夜；以浓度0.01 mol/L的PBST漂洗5 min，共4次；加入合适浓度的荧光标记二抗，避光、室温孵育2 h；以0.01 mol/L PBST漂洗3次，每次5 min(注意避光)；吸除多余的水滴并加入50 μL的抗淬灭封片剂(含DAPI)进行封片，荧光显微镜下观察并且拍照。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小胶质细胞中MDOR的表达情况

免疫荧光检测结果显示，A、B、C、D组的免疫荧光强度值分别为184.9±38.5、198.7±57.4、905.8±61.7、254.9±28.6，4组之间比较差异具有统计学意义(F=154.56，P<0.05)；与A组相比较，B组的MDOR表达无明显变化(P>0.05)；与B组相比较，C组细胞中MDOR的表达水平明显升高(P<0.05)；与C组相比，D组细胞中MDOR表达明显降低(P<0.05)。

2.2 各组小胶质细胞CD86的表达情况

免疫荧光检测结果显示，A、B、C、D组的免疫荧光强度值分别为108.5±5.5、117.2±19.4、836.5±75.8、297.8±86.0，4组间比较差异有显著统计学意义(F=104.87，P<0.05)；与A组相比，B组CD86表达无明显变化(P>0.05)；与B组相比，C组细胞中CD86蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与C组相比较，D组细胞中CD86蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。

2.3 各组细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的表达水平

ELISA法检测结果显示，A、B、C、D组细胞培养上清液中TNF-α水平分别为(0)、(0)、(12.21±0.90)、(3.28±0.33)ng/L；A、B、C、D组细胞培养上清液中IL-1β水平分别为(0)、(0)、(27.65±1.87)、(6.47±0.95)ng/L,各组比较差异有显著统计学意义(F=434.70、463.50，P<0.05)；与A组相比，B组细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的水平无明显变化(P>0.05);与B组相比，C组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β的水平明显升高(P<0.05)；与C组相比，D组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β的水平明显降低(P<0.05)。

3 讨 论

阿片受体是抑制性G蛋白耦联受体(GPCR)，多数GPCR易于形成异聚体，异聚化是受体成熟与信号输入和转运的必要条件。本研究结果显示，吗啡长时间孵育会显著增加小胶质细胞中MDOR的表达，并使小胶质细胞发生M1型激活。DOR和MOR的功能性合作被认为是疼痛相关途径中的细胞基础。在离体细胞研究中，DOR通过结合MOR形成异聚物，使得MOR能够更稳定地存在于细胞表面发挥作用[5]。吗啡可以通过激活小胶质细胞中MOR导致促炎细胞因子释放增加，同时DOR可通过稳定膜表面MOR放大MOR效应从而进一步导致细胞反应性增加。我们推测MORTM1-TAT可干扰脊髓中MDOR的形成，从而促进MDOR的降解并增强阿片类药物的镇痛作用，这也是我们团队未来关注的重点。本实验结果中MORTM1-TAT抑制小胶质细胞促炎M1型激活可能是由于DOR和MOR单体容易降解，导致细胞反应性下降；也可能是由于直接的MDOR信号下降造成的。小胶质细胞中MOR从DOR上解离或许是改善阿片类镇痛治疗的潜在策略。

本研究结果表明，吗啡可以诱导小胶质细胞促炎因子TNF-α和IL-1β的释放增加，而MORTM1-TAT能够抑制促炎因子TNF-α和IL-1β释放。在长期阿片类药物应用后，脊髓背角处小胶质细胞激活并分泌疼痛相关促炎细胞因子，从而损害吗啡镇痛作用并诱导吗啡耐受[6]。有研究表明神经小胶质细胞M1型激活参与促炎性细胞因子释放，这与本实验观察到的现象一致[7]。本研究结果显示，吗啡作用后，小胶质细胞CD86蛋白表达及TNF-α以及IL-1β的水平均增高，提示吗啡刺激能够诱导小胶质细胞向M1型分化并且促进炎性递质的分泌。MOR和DOR在脊髓组织中主要表达于小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中[8-9]。研究表明吗啡可以通过MOR介导小胶质细胞的迁移、激活与凋亡[10]。MOR的激活可增强LPS诱导的NF-κB信号通路介导小胶质细胞的促炎表型，伴随着TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放增加[11-12]，吗啡在活化的小胶质细胞中通过MOR信号通路增强了IL-1β、TNF-α等的释放，从而介导了小鼠小胶质细胞的促炎表型[12-14]。这些研究均提示MOR与M1型小胶质细胞活化密切相关，但并没有进一步探索阿片受体异聚化对小胶质细胞激活状态及促炎因子释放的影响。本研究结果显示，经MORTM1-TAT处理后，细胞TNF-α、IL-1β的释放减少，提示μ/δ阿片受体异聚化可能参与小胶质细胞M1型促炎激活状态的形成。有报道称，慢性吗啡处理后，大鼠脊髓胶质细胞内TNF-α和IL-1β的mRNA表达显著增强，TNF-α和IL-1β能够显著减弱吗啡的镇痛效果，应用TNF-α以及IL-1β受体拮抗剂可以逆转吗啡耐受[15]，这两种促炎因子的释放可能是导致吗啡耐受的主要机制之一，而MORTM1-TAT的使用或许也是逆转吗啡耐受的原因。本研究中，MORTM1-TAT并不能完全抑制吗啡诱导的TNF-α以及IL-1β释放，可能是由于MORTM1-TAT不能完全干扰DOR和MOR的结合，也可能是由于存在其他信号通路介导炎症因子的释放，但仍需进一步的证实。

综上所述，本研究表明，干扰MDOR形成能够抑制小胶质细胞向M1型分化，并降低小胶质细胞中促炎细胞因子的释放，为防治吗啡耐受提供了一定的理论依据。