CD8+ 调节性T 细胞诱导移植免疫耐受的研究进展

赵 阳，周 林，贺 强

首都医科大学附属北京朝阳医院 肝胆胰脾外科，北京 100020

肝移植是治疗各种终末期肝病的唯一有效外科手段。肝移植患者术后5 年生存率高达80%[1]，但远期预后并未因此得到显著改善。术后急慢性排斥反应导致的移植物失功严重影响患者的生存；免疫抑制剂的长期应用，虽可显著降低移植后排斥率，但可增加感染和肿瘤复发的风险，因而诱导供体特异性免疫耐受成为解决上述问题的根本办法。调节性T 细胞(regulatory T cells，Tregs) 是一种具有负向免疫调节功能的细胞亚群，在移植术后免疫耐受的形成过程中发挥重要作用[2]。目前，大多数关于Tregs 的研究主要集中在CD4+CD25+Treg 亚群，但越来越多的证据表明CD8+Tregs 在维持机体免疫平衡以及诱导免疫耐受方面扮演关键的角色，诱导供体特异的CD8+Tregs 可能成为突破免疫耐受诱导新方向[3-4]。

1 Treg 的分类与分子标志

Treg 的分类方法众多，根据其来源、抗原特异性以及作用机制可分为自然调节性Treg(natural regulatory T cell，nTreg) 和适应性调节性Treg(adaptive regulatory T cell，aTreg)，aTreg 又称诱导性调节性Treg(induced regulatory T cell，iTreg)。前者来源于胸腺髓质T 细胞，主要在预防自身免疫性疾病过程中发挥作用；后者则是由T 细胞在多条件下经过各种抗原刺激后发育而来，主要作用于微生物感染和移植免疫。根据表面分子CD4 或CD8 表达可分为CD4+Tregs 和CD8+Tregs，目前对于CD4+Tregs 亚群的作用机制已较为明确，而CD8+Tregs仍有着较大的研究空间。

1972 年，Gershon 等[5]首次发现CD8+Tregs 具有免疫抑制作用。但缺乏特异性分子标志物及检测手段落后成为研究CD8+Tregs 的最大瓶颈，导致CD8+Tregs 的研究停滞多年。国内外免疫学家研究陆续报道了几种具有特异性表型的CD8+Tregs，包括CD8+CD28-、CD8+CD25+、CD8+CD122+、CD8+CD45RClow和CD8+CD75s+Tregs，这些成果虽在一定程度上推动了CD8+Treg 的研究进展，但对于移植供体抗原特异性CD8+Tregs 表型仍存在许多的争议。

叉头转录蛋白(forkhead box protein，Foxp)-3特异性高表达于胸腺和外周的CD4+CD25+Treg 表面，是目前公认的CD4+Tregs 的特征性表型，同时其也在CD8+CD28-、CD8+CD25+和CD8+CD45RClowTreg 上表达，在普通T 细胞活化后其表面也上调性地表达Foxp3[6]，因此Foxp3 是CD8+Tregs 亚群的重要标志物，但它的缺失并不能排除CD8+Tregs的存在。CD28 缺失或低表达曾被认为是CD8+Treg特有的表面标志，并已证实CD8+CD28-Treg 细胞具有免疫抑制作用，可抑制辅助性T 细胞的活化与增殖，但从人体中分离出来的多克隆CD8+CD28-细胞却未表现出免疫抑制功能[7]。

西班牙学者曾于1994 年报道CD45RC 低表达为T 淋巴细胞分化和激活的表面标记物[8]，此后Yamacuchi 等[9]和Xystrakis 等[10]也 先 后 证 明CD45RC 可以作为大鼠CD8+Tregs 的表面标志；我中心发现在大鼠同种异体原位肝移植免疫耐受诱导过程中CD45RClowTreg 显著升高，并聚集于移植肝局部[11]。因此，CD45RClow被认为是CD8+Tregs的表面标志物。

除此之外，CD38、CD27、CD94、CD62L、神经纤维因子(neuropilin，NRP)-1、程序性死亡分子(programmed death，PD)-1[12]、 纤 维 介 素 蛋 白(fibroleukin，FGL)-2 也是CD8+Tregs 分子表型的研究焦点。目前仍缺乏特异的分子表型来鉴别不同CD8+Tregs 亚群，无法得到高纯度的相关细胞亚群，阻碍CD8+Tregs 的研究。

2 CD8+ Treg 诱导免疫耐受的机制

CD8+Treg 具有多种不同的作用机制，主要包括释放特异性细胞因子、特异性杀伤机制和阻断代谢等，原因可能是不同CD8+Treg 亚群在不同环节发挥不同作用，或存在一种占据主导地位的CD8+Treg 亚群通过不同抑制途径参与机体免疫调节。

2.1 抑制性细胞因子途径 CD8+Tregs 介导的免疫反应调节过程中，具有免疫抑制效应的细胞因子扮演重要角色。Treg 产生的抑制性细胞因子，如白细胞介素(interleukin，IL)-10、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β 和IL-35 等 已被证实在CD8+Treg 抑制特性中发挥重要作用。研究对象为小鼠时，IL-10 参与CD4+Tregs 和CD8+Tregs 的抑制作用，且根据这些细胞中IL-10 的表达水平来看，在CD8+CD122+Tregs 中IL-10 表达出比在CD4+Tregs 中更高的抑制活性[13]。同样，TGF-β 在CD8+CD122+Tregs 介导的抑制中也发挥重要作用。以非抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC) 依 赖 机 制 阻 断CD8+CD122+Tregs 对TGF-β1 的抑制作用，可逆转T 细胞增殖。在共培养实验中，类似阻断TGF-β 的实验已证明其参与多肽特异性CD8+iTregs、人角膜内皮细胞诱导Foxp3+CD25+CD8+Tregs 和人CD8+CD45RClowTregs的抑制功能[14-15]。IL-35 主要由Foxp3+nTregs 表达，是IL-12 异二聚体细胞因子家族的新成员，其在Tregs 最大抑制活性上发挥重要作用，IL-35 的异位表达可赋予原始T 细胞调节活性，重组IL-35可抑制体内T 细胞增殖[16]。

Bézie 等[17]报道了一种新发现的细胞因子IL-34 在CD4+和CD8+Treg 功能中的作用。只有CD8+和CD4+Tregs 表达IL-34。通过共培养抑制实验中使用抗体阻断IL-34，发现大鼠心脏移植模型中，IL-34 参与CD40Ig 诱导CD8+CD45RClowTregs 的抑制活性。同样，阻断IL-34 可部分消除人CD4+和CD8+CD45RClowTregs 介导的抑制作用[18]。2.2 细胞溶解途径 Tregs 的细胞溶解机制在人体中由颗粒酶A 介导，在小鼠由颗粒酶B 介导。颗粒酶B 缺乏时会降低鼠类Treg 的体外抑制活性，同时Treg 诱导凋亡具有穿孔素依赖性[19]。穿孔素被一些CD8+Tregs 用来诱导靶细胞的细胞溶解。如当Perf-/-Tregs 在体外不能抑制效应性T 细胞增殖时，Qa-1 限制性CD8+Treg 通过穿孔素介导的细胞毒作用直接杀伤靶细胞[20]。

2.3 阻断代谢途径 IL-2 是效应性T 细胞增殖和发挥免疫作用所必需的细胞因子，而Tregs 可以抑制效应性T 细胞中IL-2 的产生。首先，IL-2R、CD122 和( 或)CD25 的 高 表 达， 使CD8+Tregs 在扩增同时消耗大量的效应性T 细胞。CD122 主要由人CD8+T 细胞表达，包括CD8+Tregs 和记忆性CD8+T 细胞，CD122 或CD25 的表达使CD8+Treg对低剂量IL-2 具有较高的敏感度[21]。此外，CD8+CD28-Tregs 可影响效应性T 细胞对APC 的反应而减少IL-2 的产生，CD8+CD25+Tregs 能够通过效应性T 细胞下调IL-2R 的表达，从而抑制其增殖[22]。

2.4 调节树突状细胞途径 CD8+Treg 除通过以上途径影响效应T 细胞功能外，还可调节效应T 细胞活化所需树突状细胞的成熟和功能。树突状细胞作为功能最强的APC，在效应T 细胞发挥免疫作用过程中有着重要作用。已证实细胞毒性T 细胞相关抗原(cytotoxic T lymphocyte associated antigen，CTLA)-4 由Tregs 组成性表达，应用CTLA-4 特异性阻断抗体或CTLA-4 缺失，Tregs 都显现出功能性CTLA-4 的缺失，使Tregs 通过树突状细胞介导的效应T 细胞的抑制效应降低[23]。王盈等[24]也证实，活化CD8+Tregs 在生理或病理性免疫反应中可以负向调节树突状细胞的抗原递呈功能，降低其刺激效应T 细胞反应的能力。

3 CD8+ Treg 与肝移植免疫耐受

肝具有肝动脉和门静脉的双重血供，又是人体最大的实体器官，其含有的免疫细胞和抗原量也最多，被称为免疫特惠器官。肝移植后排斥反应发生率较其他器官移植低，急性排斥反应也更容易治疗和逆转。肝移植对ABO 血型匹配程度、HLA 配型的要求也远远低于其他器官移植[25]。

免疫抑制剂的应用使同种异体肝移植物在中短期内存活成为可能，并极大地提高了移植物存活率。但其在改善移植物存活率和限制慢性排斥病变发展的同时也带来了诸多的不良反应。因而，对于肝移植后免疫问题的解决，最佳方法是诱导供者特异性的免疫抑制状态，使移植物为宿主所接受，且不影响宿主的其他免疫功能，即移植免疫耐受。经研究，器官移植排斥反应的发病机制主要是由T 细胞介导的免疫应答，而CD8+Tregs作为T 细胞的一种重要细胞亚群，通过分泌多种细胞因子，调节机体的免疫应答，在移植免疫中发挥重要作用[26]。

Sindhi 等[27]发现肝移植受体术后体内CD8+Tregs 水平与受体术后稳定程度呈正相关，与急性排斥反应呈高度负相关。其将肝移植或小肠移植的16 例患儿分为三组并检测各组CD8+Tregs 水平变化，结果显示相比大量免疫抑制剂组，无免疫抑制剂组或少量免疫抑制剂组患儿体内更易检出CD8+Tregs，而在发生过急性排斥反应的患儿体内CD8+Tregs 水平较低。此后，Lin 等[28]也提出CD8+Tregs 的扩增与降低急性或慢性排斥反应发生率和维持良好的移植功能有关。这种结果提示大剂量免疫抑制剂治疗抑制了CD8+Tregs 产生，而排斥反应的发生消耗了大量的CD8+Tregs。因而，诱导CD8+Tregs 亚群的产生和增殖可为诱导免疫耐受提供新疗法。

4 问题与展望

Tregs 或Tregs 相关的临床试验近些年正在进行中[29-30]，目前仍无CD8+Tregs 的临床试验开展。识别特定的分子标志，可促进CD8+Tregs 免疫学功能研究。对于CD8+Tregs 免疫调节机制的研究必将成为供者特异性免疫耐受诱导中十分关键的部分。已证实CD4+和CD8+Tregs 在诱导耐受中具有协同作用[31]，两者在作用机制上的差异和协同作用需要在未来充分探索。在人或大型动物中成功诱导稳定的免疫耐受，并在临床上推广应用，任重而道远。免疫耐受必将成为解决肝移植及其他器官移植术后排斥问题的最理想治疗手段，推动临床和基础器官移植不断向前发展。