环状RNA 调控干细胞参与骨再生的研究进展

梁甲武，朱 恒，胡 巍，屈 爽，郭 斌

1 解放军总医院第一医学中心 口腔科，北京 100853 ；2 军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850

肿瘤、炎症、创伤及发育畸形是导致骨缺损的四大主要因素。骨缺损严重影响患者的外观及运动、咀嚼等重要功能。近年来的基础研究和临床试验表明，组织工程骨有望成为一种理想的修复材料，重建患者骨缺损区的形态结构及功能。干细胞是一大类具有多向分化及自我更新能力的细胞，多种干细胞被用于骨组织工程。目前研究用于骨修复的干细胞主要有骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 及 牙 周 膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs) 等组织特异性干细胞。不同的干细胞骨再生效果存在差异，可能与各种干细胞调控机制不同有关。因此，深入研究干细胞成骨进程中相关调控机制，有望进一步发挥骨组织工程的优势，达到更加理想的骨缺损修复效果。

环状RNA(circular RNAs，circRNAs) 是一类反向剪接形成的共价闭合环状结构的内源性非编码RNA[1]。最初circRNAs 发现于植物类病毒中，曾经一度被认为是错误剪接的产物。随着RNA 测序技术和生物信息学的高速发展，研究人员不但发现存在于多种生物体内的成千上万种circRNAs，而且不断认识到circRNAs 在组织器官的生长发育、疾病的发生发展方面发挥重要作用。相关结果表明，不同微环境中的干细胞circRNAs 表达存在差异，且circRNAs 的差异表达影响各类干细胞的生物学特性，如干细胞的干性维持、诱导分化、细胞增殖、细胞自我更新等，进而影响干细胞的成骨进程。本综述重点关注circRNAs 调控微小RNA(microRNAs，miRNAs) 的海绵功能，力求深入认识circRNAs 在干细胞成骨过程的表达变化及调控机制的研究现状，并阐明现有研究工作的局限性，为进一步优化基于干细胞的骨再生提供新思路。

1 circRNAs 概述

1.1 circRNAs 生物发生、分类及特点 circRNAs主要由真核生物蛋白质编码基因的前体RNA(premRNA) 通过可变剪切加工产生。与线性RNA 不同，circRNAs 不具有5’末端帽子和3’末端poly(A) 尾，通过外显子环化或内含子环化形成闭合环状结构[1]。虽然在多数真核生物中，circRNAs 是由剪接体产生，但酵母、植物和动物的具体机制似乎不同[2-3]。关于circRNAs 的具体生物合成机制也一直在探索中。近期，Li 等[4]通过冷冻电镜解析了酵母剪切体E 复合体结构，并基于该结构分析了长外显子circRNAs 的形成机制：外显子足够长的情况下，EDC 复合体可以介导pre-mRNA 内部反向剪切，最终形成circRNAs。此外，研究发现circRNAs 的形成过程除受到顺式( 内含子互补序列) 和( 或)反式因子( 剪接因子) 的严格调控外，还受诸多蛋白、分子以及基因体的表观遗传变化等因素影响。 circRNAs 根据序列来源分为外显子环状RNA(exon circRNA，EcircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNA，CiRNA) 以及外显子- 内含子环状RNA(exon-intron circRNA，EIcircRNA)。绝大多数circRNAs 属于EcircRNA。此外，circRNAs具有以下特点：1) 哺乳动物中circRNAs 的表达具有高度保守性和组织特异性[5]；2)circRNAs 具有闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，因而比线性RNA 更稳定，半衰期更长[6]；3)circRNAs 整体表达丰度低于mRNA。对于大多数同时含有线性和环状RNA 的基因，circRNAs 的数量为线性数量的0.1% ～ 10%，大多数小于1%[7]。但据Jeck 等[8]报道，至少有50 个基因的circRNAs 丰度比线性RNA 更高。

1.2 circRNAs 的生物学功能

1.2.1 miRNAs 海绵作用 近年来，多项研究发现某些circRNAs 分子通过表面的miRNA 反应原件(miRNA response elements，MREs) 选择 性吸附miRNAs，降低miRNAs 的表达水平，进而解除其对下游靶mRNA 的抑制，调控下游靶基因表达。这种作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA) 机制，又称海绵机制。如circCAMSAP1 作为miR-328-5p 的海绵，阻断了miR-328-5p 对转录因子E2F1 的抑制，促进了大肠癌细胞的增殖和侵袭，预测circCAMSAP1 可作为大肠癌的诊断和预后生物标志物以及潜在的治疗靶点[9]；此外，Li 等[10]研究发现，Circ-0002483 可结合多个miRNA，包括miR182-5p、miR-520q-3p、miR-582-3p、miR-587 和miR-655。 其 中Circ-0002483 通 过 对miR-182-5p 的海绵作用，调控miR-182-5p 的靶基因GRB2、FOXO1 和FOXO3 的表达，从而抑制非小细胞肺癌的发展，并增强非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的敏感度。

1.2.2 与RNA 结合蛋白相互作用 RNA 结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs) 在RNAs 转录后调控、参与组织发育和疾病发生发展。以往研究表明，RBPs 在多种组织中均有表达，但某些RBPs 具有组织特异性或仅在病理条件下产生，可作为疾病的生物标志物[11]。Abdelmohsen 等[12]发现过表达circPABPN1 可以抑制Hur 与PABPN1 mRNA 的结合，而PABPN1 mRNA 多聚体分析发现，PABPN1的翻译受Hur 正向调控和circPABPN1 负向调控。因此，circPABPN1 与Hur 结合阻止了Hur 与PABPN1 mRNA 的结合，并降低了PABPN1 的翻译水平。最新研究报道，circSKA3 可促进TKS5 定位至细胞膜，与Integrin β1 相互作用，促进侵袭性伪足的形成，从而促进乳腺癌转移[13]。

1.2.3 调控基因转录 据目前研究，位于细胞核内的某些ciRNAs 和EIcircRNAs 具有转录调控功能。Kwek 等[14]发现，每个EIcircRNAs 在保留的内含子中都有一个U1 snRNA 结合位点，该位点可通过Pol Ⅱ促进磷酸二酯键的形成。Li 等[15]发现circPAIP2 和circEIF3J 与U1 snRNA 相互作用，可促进其亲本基因转录。也有研究发现，ciRNA 在转录伸长阶段控制转录。ci-ankrd52 特异地合成反义寡核苷酸(synthetic antisense oligodeoxynucleotides，ASO) 与ankrd52 的pre-mRNA 内 含 子 互 补， 可能与pre-mRNA 结合，并降解pre-mRNA，导致mRNA 水平下降。此外，ASO 介导的ci-MCM5 和ci-SIRT7 的敲除也得到了类似的结果[16]。最新研究发现，circSamd4可通过抑制PURA和PURB蛋白，从而减轻PUR 蛋白对MHC 启动子的转录抑制作用，间接促进肌源性分化[17]。

1.2.4 参与蛋白质翻译 circRNAs 除具有miRNAs海绵和调控RBP 等非编码功能外，某些circRNAs还可编码。但由于circRNAs 不含5' 帽子结构，翻译circRNAs 通过内部核糖体进入位点(IRES)，以帽子独立的方式翻译。Zhang 等[18]发现位于起始密码子下游的IRES，能够驱动circSHPRH 的翻译启动。circSHPRH 产生一种新的蛋白质SHPRH-146aa，并可被质谱检测，SHPRH-146aa 可保护相关的全长SHPRH 蛋白质不被降解，抑制胶质母细胞瘤的细胞增殖和致瘤性。此外，circ-AKT3 通过重叠的起始- 终止密码子UAAUGA 编码174-aa蛋白，即AKT3-174aa。AKT3-174aa 过表达可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖，辐射抗性和致瘤性[19]。

2 circRNAs 参与干细胞骨再生过程

2.1 circRNAs 调控干细胞成骨分化 Zhang 等[20]通过微阵列分析发现BMSCs 成骨分化过程中的circRNAs 表达谱存在差异。与成骨分化第0 天(D0) 相 比， 第7 天(D7) 的BMSCs 上 调 了3 938 个circRNAs，下调了1 505 个circRNAs。Della Bella[21]利用RNA 杂交阵列对BMSCs 成骨分化过程中差异表达的circRNAs 进行鉴定，结果表明，与对照组(D0) 相比，成骨分化组(D7) 有21 个表达上调的circRNAs 和21 个表达下调的circRNAs。此外，Ouyang 等[22]发现骨不连患者的BMSCs 中circ-0074834 表达降低，进一步实验发现circ-0074834可结合miRNA-942-5p， 而后者通过靶向调控ZEB1 和VEGF 的表达，抑制BMSCs 的成骨分化，这提示circ-0074834 可能作为miRNA-942-5p 的海绵促进BMSCs 的成骨分化及骨缺损修复。

此外，Peng 等[23]从正常和BMP2 诱导的上颌窦膜干细胞(maxillary sinus membrane stem cells，MSMSCs) 成骨分化过程中circRNAs 的差异表达谱中筛选出可能影响MSMSCs 成骨分化的circRNA—circRNA-33287。进一步研究发现，circRNA-33287的过表达/ 敲低，升高/ 降低了成骨的关键标志Runx2、Osx/ALP 的 表 达 水 平。circRNA-33287吸附miR-214-3p，靶向其3' 端非编码区来调控Runx3 的表达。动物实验发现，circRNA-33287 可促进异位骨形成，并且与miR-214-3p 抑制剂共转染时刺激骨形成的能力最强。因此，circRNA-33287 作为miR-214-3p 的分子海绵，靶向上调Runx3 表达，从而促进MSMSCs 成骨分化。

另有研究发现，CDR1as 对PDLSCs 成骨分化具有调节作用[24]。Li 等[24]研究发现CDR1as 在PDLSCs 成骨分化过程中显著上调，而miR-7 水平下调。CDR1as 的敲除和miR-7 的过表达可抑制ALP 活性及成骨基因的表达，降低Smad1/5/8和p38MAPK 的磷酸化水平。动物实验中发现，CDR1as 敲除组骨修复效果明显不如对照组。因此认为，CDR1as 竞争性结合miR-7，上调Smad1/5/8和p38MAPK 磷酸化水平， 从而促进PDLSCs 的成骨分化。 此外，Chen 等[25]发现CDR1as 基因敲除促进BMSCs 成骨分化、抑制成脂分化，过表达CDR1as 则导致BMSCs 成骨分化减少、成脂分化增加。后通过荧光素酶报告基因分析发现，CDR1as 通过靶向miR-7-5p/Wnt 5B 轴促进BMSCs的成脂分化，抑制成骨分化。综上所述，同一种circRNAs 在不同干细胞，或干细胞的不同分化阶段可能存在差异表达，甚至可能发挥截然相反的作用。需深入发掘其内在调控机制，才有望让其成为调控颌骨再生“利器”。

2.2 circRNAs 调 控 干 细 胞 增 殖 Wang 等[26]研究发现， 在LPS 诱导的炎症条件下，PDLSCs中CDR1as 的表达水平明显低于正常PDLSCs，PDLSCs 的增殖能力亦低于正常PDLSCs。进一步研究发现，对于LPS 处理后的PDLSCs，过表达miR-7 可抑制PDLSCs 增殖，敲除miR-7 则促进PDLSCs 增殖；而过表达CDR1as 可减轻LPS 诱导的PDLSCs 增殖抑制，敲除CDR1as 则会增强抑制作用。根据之前已有报道，CDR1as 可作为miR-7海绵发挥生物学功能，miR-7 可通过靶向ERK 信号通路抑制细胞增殖。因此认为，CDR1as 作为miR-7 海绵，激活ERK 信号通路，促进LPS 诱导炎症条件下的PDLSCs 增殖。此外，Ren 等[27]将经或不经降钙素基因相关肽(CGRP) 刺激的骨髓间充质干细胞产生的RNA 用于微阵列检测circRNAs的表达，发现CGRP 刺激小鼠BMSCs 前后有58个circRNAs 显著差异表达。进一步研究发现，沉默mmu-circRNA-003795 可以上调miR-504-3p的表达，而后者可靶向结合FOSL2 抑制细胞增殖。此外，使用miR 抑制剂沉默miR-504-3p 可上调FOSL2。因此，mmu-circRNA-003795 通过对miR-504-3p 的海绵作用，间接调节FOSL2 mRNA的表达，促进BMSCs 增殖。

此外，与上述circRNAs 促进细胞增殖不同，有研究发现某些circRNAs 可抑制干细胞增殖。Kuang 等[28]研究发现与未患激素性股骨头坏死(GIONFH) 的患者相比，GIONFH 患者circUSP45的表达增加。进一步研究发现，过表达circUSP45降低了成骨基因的表达，抑制BMSCs 增殖。此外，circUSP45 主要定位于细胞质中，并与miR-127-5p 直接相互作用。miR-127-5p 与其靶点PTEN 共同作用于BMSC 成骨调控。因此，circUSP45 通过竞争性结合miR-127-5p，调控PTEN/AKT 信号通路，抑制BMSCs 增殖及成骨进程。

2.3 circRNAs 调控干细胞自我更新 干细胞的自我更新是一个由多种外源性细胞因子和内源性转录因子协同作用的非常复杂的调控过程。前期研 究 发 现MEK/ERK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和JAK/STAT 等信号通路对干细胞状态的调控具有重要意义，但circRNAs 在这一过程中的作用仍尚不明确[29]。Cherubini 等[30]近期研究发现，circFOXP1 海 绵 吸 附miR-17-3p 和miR-127-5p，通过表皮生长因子受体(EGFR) 和非典型Wnt 信号通路调节人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs) 生长和分化之间的平衡，并提出控制干细胞自我更新与分化之间的平衡是维持组织内稳态的关键。这提示了circFOXP1 可能通过EGFR 和非典型Wnt 信号通路调节iPSCs 自我更新和分化，进而促进骨再生。此外，早期有研究报道，miR-145 过表达会导致胚胎干细胞(HESCs) 自我更新能力降低[31]，而miR-145 会受到circRNA-00156 的海绵抑制，调控下游靶基因表达[32]，因此推测某些circRNAs 可能潜在影响成骨干细胞的自我更新，但目前尚未发现。综上所述，circRNAs 可能在成骨干细胞自我更新中发挥着重要作用，具体相关机制有待进一步探索。

2.4 circRNAs 调控成骨细胞的功能 在颌骨再生过程中，成骨干细胞终将分化为成骨细胞进行骨缺损区修复。因此，circRNAs 对成骨细胞的调控成为影响骨再生效果的又一重要因素。Mi等[33] 发现骨折愈合过程中PIK3R1 的表达增加与MC3T3-E1 细胞增殖增强和凋亡减少直接相关。此外，miR-7223-5p 靶向PI3KR1，在促进凋亡的同时 抑 制MC3T3-E1 的 增 殖。 而circRNA AFF4 作为miR-7223-5p 的海绵，促进MC3T3-E1 细胞增殖，抑制细胞凋亡。股骨骨折处局部注射circRNA AFF4 可促进骨折愈合，而注射miR-7223-5p 则阻碍骨折愈合。这些发现提示circRNA AFF4 通过靶向miR-7223-5p/PIK3R1 轴促进成骨细胞增殖和抑制凋亡，进而促进骨修复。此外，BMP2 可通过Circ-19142/Circ-5846 靶 向miR-7067-5p 促 进MC3T3-E1 细胞生长发育，且与参与细胞生长和分化的FGF、EGF、PDGF 和Wnt 信号通路密切相关[34]。

3 小结与展望

全面认识干细胞成骨的调控机制有助于优化以干细胞为核心的骨再生策略，提升骨再生的安全性和有效性。随着新一代测序技术和生物信息学的高速发展，circRNAs 的生物发生机制和生物学功能得到了深层次的发掘。circRNAs 在干细胞介导的骨再生领域的作用仍有广阔的探索空间。相关工作将对推动骨组织工程发展，促进干细胞在骨再生中的应用提供理论和实验支持。