昆虫病原真菌鉴定方法研究进展

黄 姗 孔丽娜 闫金国 王大鹏

（潍坊护理职业学院，山东青州 262500）

昆虫病原真菌是能侵入昆虫体内寄生，从而使昆虫发病致死的一类真菌的统称，也称虫生真菌。在农业生产中，虫生真菌能有效控制害虫种群数量。据统计，60%的死亡昆虫是由真菌流行病发生引起的[1]。昆虫病原真菌种类多，寄主范围广，安全有效，不伤害天敌，不易产生抗性，在害虫控制上具有独特优势。早在20世纪80年代，昆虫病原真菌的研究就得到了广泛重视，而其种类的精确鉴定和系统发育进化关系的分析是研究的前提。基于此，本文对昆虫病原真菌主要的鉴定方法进行总结，从鉴定原理、应用现状及取得的成果等方面进行论述，以期为昆虫病原真菌的系统发育进化关系分析、精确的分类鉴定及菌种资源开发提供理论指导。

1 昆虫病原真菌的形态学鉴定

真菌的形态学鉴定是指依据真菌的形态特征和生理生化等特性进行分类的一种鉴定方法。昆虫病原真菌的形态特征主要包括菌落特征和显微特征两个方面，形态学鉴定一般先通过菌落特征初步对真菌进行分类，再通过显微镜观察真菌孢子的形态，进一步确定真菌的种属。近年来，自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析等现代形态学技术的发展明显提高了真菌形态学鉴定的准确率。但由于描述真菌表型的各种词语具有很大的主观性，没有统一特定的标准，加之真菌种类繁多、形态特征复杂，某些表型特征不稳定，易受环境影响，形态学鉴定具有很大的局限性。

2 昆虫病原真菌的分子生物学鉴定

2.1 基于PCR的核酸序列分析 PCR技术的出现使真菌鉴定有了新的突破。编码核糖体rDNA分子的基因序列因其结构上的高度保守性和基因间隔区（IGS）的多变性，被广泛应用于揭示生物进化发育关系。目前，在真菌鉴定中应用最广泛的核酸序列是核糖体rDNA的转录间隔区ITS（位于28SrDNA的3′端与18SrDNA的5′端之间的序列称为核糖体内转录间隔区ITS，ITS1位于18SrDNA和5.8SrDNA之间，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之间）。在真菌的分类鉴定中，核糖体小亚基编码基因18SrDNA和基因间隔区（ITS）序列是最常用的。以上序列分析可以鉴定到种、亚种、变种甚至菌株的水平[2]。相关学者分析了20个种的转录间隔区ITSl和ITS2序列，发现这两个序列仅在种间存在差异，种内是完全一致的[3]。邱君志等的研究发现16株座壳孢核糖体大亚基LSUrDNA序列的分子聚类结果与其形态学鉴定结果一致，这表明核糖体大亚基LSUrDNA序列可用于本属种和种以下分类单元的鉴定[4]。目前，国内外一般利用PCR扩增病原菌核糖体转录间隔区ITS进行病原菌的鉴定、检测及病害诊断。此方法具有快速、准确、简便等优点，深受微生物学家的重视，为昆虫病原真菌的分子生物学研究奠定了重要基础。

目前，ITS序列提供的遗传信息有限，有时并不能有效区分关键进化节点。近年来，逐渐广泛应用的多基因序列联合分析技术极大地提高了微生物系统进化分析及种类鉴定的准确性。Kepler等基于ITS、GAPDH、CAL、ACT、CHS多基因联合分析，对胶孢炭疽菌复合体Colletotrichum gloeospori-oides complex进行了系统进化分析[5]。重庆大学王萌等采用管家基因ef1-α、rpb1、rpb2、β-tubulin联合对10株绿僵菌菌株的分类地位进行了系统进化分析。研究结果表明，通过单基因及多基因联合序列分析能更准确地对供试菌株进行分类鉴定[6]。

2.2 基于限制性内切酶的限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性RFLP是利用限制性内切酶对不同的基因组进行酶切得到长短、种类、数目不同的限制性片段对真菌进行鉴定的方法。RFLP技术不仅适用于昆虫病原真菌群体水平的研究，还适用于系统发育进化分析方面的研究。但RFLP技术依然存在缺陷性，这是因为限制性酶切图谱中特征性的条带主要是基因组DNA中具有高度重复序列的酶解片段，如mtDNA和rDNA，但mtDNA或rDNA在生物进化演变过程中均是保守序列，产生的RFLP是有限的，并不能完全反映不同菌株之间存在的差异。

2.3 随机扩增多态性DNA分析 随机扩增多态性DNA分析是基于PCR的分析技术。扩增的产物通过凝胶电泳显示DNA片段的数量和大小，可以反应DNA片段的多态性，从而比较菌株之间存在的基因差异。此技术具有用量少、鉴定迅速等优点，被广泛应用于丝状真菌的鉴定、分类研究，特别适用于遗传背景不清的基因分析。

2.4 PFGE技术 脉冲电场凝胶电泳技术在真菌的分离鉴定中应用广泛。时连根等的研究发现，白僵菌的3种菌株6条染色体的大小在供试的3个菌株间存在差异，其核型在各菌株间存在多型性，3个菌株的染色体大小在2.5～7.2 Mbp，核型大小在26.5～29.0 Mbp[7]。

采用PFGE技术得到的核型图谱为真菌分类提供了依据。研究发现，金龟子绿僵菌、白僵菌属和弯颈霉属存在种的特异性和种内核型多态性。核型多态性的研究将随着脉冲电泳技术的进一步改进而得到更加广泛深入的发展，更多的同源DNA探针也将应用于染色体DNA进行分子杂交。

当然，PFGE技术还存在一些问题，如不能有效分离分子量相近的染色体DNA，脉冲电泳中分离的每一条染色体带不纯，目的染色体上获得的DNA片段易被污染，DNA降解造成的分型失败等，这些问题都需进一步研究改进。

3 结语

综上所述，昆虫病原真菌的分类鉴定可采用多种方法，但每种方法都存在优缺点，研究者应该根据实际情况加以选择，或将多种方法相结合共同确定虫生真菌的分类。