微RNA-346 对食管癌细胞生物学行为影响的分子机制研究

赵明理，刘雷，曹建西，崔琳

作者单位：河南中医药大学第一附属医院心胸外科，河南 郑州 450000

食管癌是全球第八大最常见的肿瘤，也是肿瘤相关死亡的第六大常见原因［1-2］。食管癌的发病因素主要包括吸烟、饮酒、环境因素及对食管造成损伤的各种慢性刺激等［3］。近年来，尽管食管癌的治疗方式与方案得到极大的发展，然而食管癌治疗的远期效果仍难令人满意［4］。微RNA（miRNA）是一类内源性非编码RNA，在细胞增殖、衰老、凋亡、转移等多种细胞生物学行为中发挥重要作用，与肿瘤的发生发展密切相关［5］。miR-346 是一种新发现在多种肿瘤中具有促癌或抑癌作用的miRNA［6-8］，然而其在食管癌中的机制研究尚未明了。本研究拟通过观察miR-346 对食管癌细胞生物学行为的影响，探讨其可能的分子作用机制，为miR-346 靶向治疗食管癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床标本收集2016年10月至2017年4月河南中医药大学第一附属医院心胸外科存档的食管癌癌标本和癌旁标本6对，所有病例均经病理证实。所有病人均为首次确诊病例。病人术前均未行任何辅助治疗，标本取出后立即至于液氮罐内保存。本研究获本院伦理委员会批准，病人对研究方案签署知情同意书。

1.2 材料人正常食管黏膜上皮细胞株HET-1A和4种食管癌细胞株（TE-1、Eca109、Eca9706、KYSE150）购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM 培养基、RPMI 1640 培养基和FBS购自美国Gibco公司。Trizol试剂盒购自美国Invitrogen 公司。qPCR 相关试剂盒购自美国Promega 公司。PCR 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。miR-346慢病毒及空载病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。噻唑蓝（MTT）试剂盒购自美国Sigma公司。细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物技术研究所。一抗β-actin、Yes 相关蛋白1（YAP1）及细胞周期蛋白E（Cyclin E）、细胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）购自美国CST公司。

1.3 细胞培养、感染及分组HET-1A和TE-1培养于 含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，Eca109、Eca9706 和KYSE150 培养于含10% FBS 的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。以TE-1为感染对象，感染miR-346慢病毒的TE-1细胞组为实验组，转染空载慢病毒的细胞组为阴性对照组。具体方法：以对数生长期的TE-1 细胞为感染对象，待细胞融合度达到50%，将miRNA346 慢病毒或空载慢病毒感染TE-1 细胞。24 h后更换培养液，供后续实验。

1.4 qPCR 检测miR-346 和YAP1 基因表达水平根据Trizol 试剂盒说明书提取组织或细胞总RNA，反转录为cDNA，按照qPCR试剂盒说明书，以U6或GAPDH 分别进行qPCR 扩增检测miR-346 和YAP1基因表达水平，扩增数据采用2-△△Ct法进行定量统计分析。GAPDH 引物序列（5′～3′）：Forward GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Reverse Primer GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。YAP1 引物序列（5′～3′）：Forward TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA，Reverse TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT。

1.5 MTT 法检测感染后的两组TE-1 细胞，胰酶消化后接种于96 孔板，于接种后1、2、3、4 d 分别进行MTT 检测。具体检测：在每个时间点，每孔加入20 μL MTT 溶液，培养箱内孵育4 h，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡10 min。酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光度（optical delnsity，OD），绘制细胞生长曲线。

1.6 集落形成实验取生长状态良好的两组细胞，胰酶消化、制备单细胞悬液，以1 000 个/孔接种于6孔板，培养箱内连续培养10 d，隔天更换新鲜培养基。10 d后弃上清，甲醇固定10 min，0.1%结晶紫溶液染色20 min，洗去多余染液，观察统计集落数量。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡收集感染后的细胞，用预冷的PBS缓冲液洗2遍，加入200 μL凋亡结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC溶液和10μl PI溶液，避光孵育30 min，流式细胞仪检测10 000个细胞，统计凋亡比例。

1.8 蛋白质印迹法检测收集感染后的两组细胞，细胞裂解液裂解提取总蛋白，定量后分别取两组蛋白样本50 μg 进行SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭液封闭2 h，4 ℃一抗孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，ECL 显影剂发光显影反应，以β-actin 作为内参进行标准对照，每组实验重复3次。

1.9 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-346 在临床食管癌组织中的表达水平qPCR 检测结果显示，与癌旁组织相比，miR-346 在食管癌组织中的表达量明显下降（2.20±0.32 比0.89±0.14，P＜0.01）。见图1。

图1 miR-346在食管癌组织和癌旁组织中的表达水平

2.2 miR-346 在正常食管黏膜上皮细胞和食管癌细胞中的表达水平qPCR检测结果显示，miR-346在4种食管癌细胞（TE-1、Eca109、Eca9706 和KYSE150）中的表达量（0.22±0.02、0.45±0.08、0.65±0.08、0.53±0.04）均显著低于正常人食管黏膜上皮细胞HET-1A（1.06±0.36），差异有统计学意义（P＜0.01），其中TE-1细胞中miR-346下降的最为明显。见图2。

2.3 miR-346 在两组细胞中的相对表达量慢病毒感染TE-1细胞后，实验组的miR-346显著高于对照组（265.75±78.78比1.06±0.36，P＜0.01）。

图2 miR-346在正常食管黏膜上皮细胞和食管癌细胞中的表达水平

2.4 miR-346 对细胞活力的影响自第3 天开始，与对照组相比，miR-346 慢病毒感染的TE-1 细胞的活力显著降低（1.37±0.06比0.93±0.06），差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图3 miR-346对TE-1细胞活力的影响

2.5 miR-346 对细胞增殖能力的影响通过统计实验组TE-1细胞的集落数目和大小，实验组集落的数目及大小明显低于对照组（232.3±37.40比82.55±9.66，P＜0.01）。结果表明，miR-346 过表达能有效抑制TE-1细胞的增殖能力。

2.6 miR-346 对细胞凋亡的影响实验组TE-1 细胞的凋亡率显著多于对照组（8.26%±0.80%比0.94%±0.28%，P＜0.01），提示过表达miR-346具有诱导TE-1细胞凋亡的作用。

2.7 miR-346靶基因预测结果microRNA.org-Targets and Expression 在线预测软件（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）显示，miR-346 与YAP1 mRNA 3′UTR区域存在结合位点。见图4。

2.8 qPCR 检测YAP1 mRNA 表达实验组TE-1细胞中YAP1 mRNA 较对照组表达量明显下降（0.44±0.11比1.00±0.04，P＜0.01）。

2.9 蛋白质印迹法结果与对照组相比，实验组TE-1 细胞中YAP1、Cyclin E 和cIAPl 蛋白表达量显著下降。见图5。

图5 两组细胞中Yes相关蛋白1（YAP1）及细胞周期蛋白E（Cyclin E）、细胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）蛋白的表达情况

3 讨论

miRNA是由20-24个核苷酸构成的单链非编码RNA，属于基因表达的转录后调控因子，miRNA在机体内广泛存在，通过与靶基因mRNA的3′非翻译区域的互补序列相结合，起到抑制靶基因表达的作用［9］。若miRNA 与靶基因完全互补配对，导致靶基因mRNA的降解；若miRNA与靶基因不能完全互补配对，则导致靶基因mRNA翻译的抑制［10］。miRNA、靶基因及表型之间存在复杂相互作用，miRNA已经成为各种疾病诊断、治疗效果、预后评估的生物标志物。近年来研究表明，miR-145-5p、miR-130a、miR-99a等［11-13］众多miRNA参与食管癌的发生发展。

miR-346 参与多种疾病的病理过程。在糖尿病肾病小鼠模型中，miR-346 作为SMAD3/4 的负调节因子，通过减少肾组织中SMAD3/4 表达，改善了糖尿病肾病小鼠小鼠的肾功能，延缓糖尿病肾病的进展，miR-346 可能作为糖尿病肾病治疗的靶标分子。miR-346 通过靶向Bcl-6 基因的表达，调节CD4（+）CXCR5（+）T 细胞数量，并且可能在Graves 病的发病过程起重要作用［14］。miR-346在多种肿瘤中发挥明显的促癌或抑癌作用。miR-346在皮肤鳞状细胞癌中的表达升高，通过干扰SRCIN1 基因的表达促进皮肤鳞状细胞癌的增殖和迁移［15］。miR-346通过靶向抑制SRCIN1 基因的表达，促进乳腺癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭，并减少细胞凋亡，同时降低降低乳腺癌细胞对多西紫杉醇的化学敏感性［16］。Argonaute 2 蛋白对于miRNA 的活性至关重要，miR-346可增强Argonaute 2蛋白的表达，导致其他miRNA的活性增加，并促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭［17］。miR-346 通过靶向抑制BRMS1 基因的表达，促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭［6］。miR-346在非小细胞肺癌中属于致癌性miRNA，通过调控XPC基因的表达，促进非小细胞肺癌细胞生长和转移［7］。肝细胞癌组织中miR-346 表达显著下调，且与肿瘤大小和TNM分级有关，miR-346通过干扰SMYD3基因的表达抑制肝细胞癌细胞增殖，同时Cox 比例风险分析表明miR-346的低表达是HCC的独立预后因素［8］。miR-346在食管癌中的研究尚未见报道。

图4 miR-346与YAP1 mRNA 3′UTR互补配对区域

我们发现，过表达miR-346 后食管癌细胞的活力和增殖能力显著下降，细胞凋亡显著上升，miR-346 具有抑制食管癌细胞生长的作用。通过microRNA.org-Targets and Expression 在线预测软件发现，YAP1 可能是miR-346 的靶基因。YAP1 是一种癌基因，在多种肿瘤中表现为高表达，参与肿瘤的发生发展［18］。YAP1 是Hippo-YAP 通路负向调控的下游效应分子，Hippo-YAP 信号通路通过调节细胞增殖与凋亡，在肿瘤发生发展中发挥重要的抑癌作用。当Hippo-YAP 信号通路失活时，YAP1 表达上调［19］。YAP1 mRNA 和蛋白在食管癌组织中明显上调，且YAP1 与食管癌的转移和肿瘤分期密切相关［20］。我们发现，过表达miR-346 后的食管癌细胞中YAP1 基因表达下降。高表达的YAP1 可诱导细胞周期蛋白E（Cyclin E）和细胞凋亡抑制蛋白1（cIAPl）等基因的表达，促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡，促进肿瘤的发生发展［21-22］。Cyclin E 和cIAPl蛋白表达变化与文献一致。

总之，本组实验结果提示，miR-346在食管癌组织以及食管癌细胞株中均呈低表达，能明显抑制食管癌细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，其可能机制是干扰YAP1 基因的表达。miR-346 或许可成为治疗食管癌的新靶点。