高效液相色谱法测定硫酸沙丁胺醇有关物质的含量

王鑫，刘宏大，薛雁，李萍，邸伟庆

作者单位：1蓬莱诺康药业有限公司，山东 蓬莱 265600；2辽宁远大诺康生物制药有限公司，辽宁沈阳 110171

硫酸沙丁胺醇为选择性β2受体的激动剂，能选择性的激动支气管平滑肌β2受体，使平滑肌松弛，支气管扩张的作用较强［1-4］。硫酸沙丁胺醇原料药在《美国药典》（USP40）、《欧洲药典》（EP9.0）［5］及《中国药典》2015年版［6］中均有收载，硫酸沙丁胺醇有多种合成方法，根据图1所示合成路线分析，在第5到第6反应步骤中可能产生杂质有A、C、D、F、M、J，在最后一步反应中有可能产生杂质O；根据图2所以合成路线分析，有可能在最后一步生成杂质C、E、F、G、O、J；除以上2条路线外，其他路线有可能产生B、K、L、Q、I等杂质，为快速准确的检测以上合成工艺中产生的杂质。本文参考EP9.0方法并对该方法优化，建立检测14种杂质的有关物质方法并按相关指导原则进行了方法学验证［7］，其中杂质G各国药典中均未收录，本方法可对杂质G进行检测，杂质G与其它杂质分离度达到要求，由于在原料产品中未检出杂质G，所以没有进行方法学考察；根据原料中检出的杂质C、M并且结合EP9.0中的已知杂质C、D、F、O，本文对杂质C、D、F、M、O 进行方法学考察。14种杂质包括杂质A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J（结构式见图3）。

图1 硫酸沙丁胺醇合成路线1

图2 硫酸沙丁胺醇合成路线2

图3 硫酸沙丁胺醇合成过程中产生的杂质A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J结构图

1 仪器与材料

LC-20A日本岛津高效液相色谱仪；Mettler toledo天平；pH计美国Eutech Instrument公司。

硫酸沙丁胺醇原料药，常州亚邦制药有限公司；硫酸沙丁胺醇对照品100 毫克/瓶，批号100328-200703（纯度99.3%），国家药品标准物质中国食品药品检定研究院；杂质Salbutamol Impurity A 批号1592-081A2、C 批号1598-060A3、E 批号2480-016A3、K 批 号1711-012A1、M 批 号1989-055A2、O 批号1797-074A4、Q 批号1816-031A2（以上杂质采购于加拿大TLC 公司）、B 批号Y0000030、D 批号Y0000071、F 批号Y0000031、G批号Y0000034、I 批号Y0000032、J 批号Y0001186（以上杂质采购于欧洲EDQM）、L 批号9E-11-3（美国CATO 公司）。庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾，磷酸，磷酸二氢钠，三乙胺，盐酸，氢氧化钠，30%过氧化氢溶液（国药），甲醇，乙腈（Fisher）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱条件如下：色谱柱：Hypersil Gold C8柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相：流动相A：3.45 g一水合磷酸二氢钠用900 mL 0.05%的三乙酸胺溶液溶解，以稀磷酸调节pH 至3.0 之后用0.05%的三乙酸胺溶液定容至1 000 mL。流动相B∶甲醇∶乙腈＝20∶80。按表1 进行梯度洗脱；检测波长：273 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃。

表1 梯度洗脱程序表

2.2 系统适用性试验取杂质A、B、C、D、E、F、G、K、M、O、L、Q、I、J及硫酸沙丁胺醇对照品各适量，精密称定。以流动相A 溶解，该混合溶液作为对照品溶液；进样分析，记录色谱图。各杂质之间分离度均符合要求，其中杂质间最小分离度为1.6。扣除空白的HPLC图谱见图4。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备 取硫酸沙丁胺醇原料药约20 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，用2.1 项中流动相A 溶解，定容后摇匀，配制成每1 mL 中约含硫酸沙丁胺醇0.4 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.3.2 杂质对照品溶液的制备 分别取杂质C、杂质D、杂质F、杂质M、杂质O对照品各适量，精密称定，置于量瓶中，用稀释液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含杂质对照品45 μg的溶液，作为对照品储备液。

2.4 专属性试验［8］精密称取硫酸沙丁胺醇原料药20 mg 4 份，分置于50 mL 量瓶中，分别经过酸、碱、氧化、光照破坏后，加入流动相A稀释至刻度，作为破坏样品溶液。（1）酸破坏：样品中加入3 mol/L HCL 溶液6 mL，85 ℃水浴加热2 h 后，加入3 mol/L NaOH 溶液6 mL 中和；（2）碱破坏：样品中加入3 mol/L NAOH 溶液3 mL，85 ℃水浴中加热2 h 后，加入3 mol/L HCL 溶液3 mL 中和；（3）氧化破坏：样品中加入300 g/L 过氧化氢溶液1 mL，85 ℃水浴中加热2 h；（4）光照破坏：样品加入稀释液溶解并定容，摇匀，置（4 500±500）lx 光照培养箱中照射5 d；（5）高温破坏：取硫酸沙丁胺醇原料药20 mg，于130 ℃烘箱中加热1.5 h，冷却，用稀释液溶解并稀释至50 mL；取上述各破坏供试品溶液，过滤后测定。扣除空白的HPLC图谱见图5。图5可知，本品经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，各降解产物峰与硫酸沙丁胺醇峰均完全分离。2.5 线性考察与定量限和检测限［9-10］的确定 精密称取105 ℃干燥3.5 h 后的硫酸沙丁胺醇对照品约45 mg，置100 mL 量瓶中，用稀释液溶解并定容，取1 mL定容至10 mL量瓶中，摇匀，作为硫酸沙丁胺醇对照储备液；另精密称取杂质C、D、F、M、O 对照品适量，按“2.3.2”项方法制备各杂质的对照储备液。

图4 《欧州药典》方法高效液相色谱图

图5 专属性试验色谱图：A为酸破坏；B为碱破坏；C为氧化破坏；D为高温破坏；E为光照破坏；F为无破坏

精密量取硫酸沙丁胺醇及杂质C、D、F、M、O对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，分别置于10 mL 量瓶中，以流动相A 稀释后定容，摇匀，检测后记录峰面积。以质量浓度（ρ，μg/L）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标分别绘制标准曲线。取硫酸沙丁胺醇及各杂质对照储备液，逐级稀释后检测，以信噪比（10∶1）时的质量浓度为定量限、信噪比（3∶1）时的质量浓度为检测限，结果见表2，线性关系良好，定量限及检测限能够满足各特定杂质检测的要求。

2.6 精密度试验精密量取“2.5”项的硫酸沙丁胺醇对照品储备液0.1、0.5 和1.0 mL，分置于10 mL 量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，制成低（0.45 μg/mL）、中（2.25 μg/mL）、高（4.5 μg/mL）3 个质量浓度的供试品溶液，每个质量浓度各配制3 份。分别进样，记录色谱图，计算低、中、高3个质量浓度的相对标准偏差（RSD），结果分别为3.6%、2.9%和2.2%，表明本法重复性良好。

精密量取“2.5”项的杂质C、D、F、M、O对照品储备液方法同上，其相对标准偏差（RSD）分别为：0.7%～2.6%（杂质C）；0.8%～3.1%（杂质D）；0.7%～3.5%（杂质F）；0.8%～1.9%（杂质M）；0.9%～3.5%（杂质O），表明本法对杂质C、D、F、M、O检测的重复性良好。

2.7 稳定性试验取硫酸沙丁胺醇原料药20.01 mg，按“2.3.1”项方法制备供试溶液，分别放置0、1、2、4、6、8、10和12 h进样，按外标法计算。平均总杂质为0.65%，RSD为1.6%（n＝8），在12 h内各有关物质含量无明显变化。结果表明：供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 回收率试验［11-13］取硫酸沙丁胺醇原料药约45 mg，置于100 mL量瓶中，取1 mL置于10 mL量瓶中，作为样品，共9份，精密加入杂质C、D、F、M、O的对照品储备液0.1、0.5 和1.0 mL 各3 份，定容后摇匀，配制成低（0.45 μg/mL）、中（2.25 μg/mL）、高（4.5μg/mL）3 个浓度的供试品溶液。另精密量取杂质C、D、F、M、O 对照品储备液各0.5 mL，置于同一个10 mL量瓶中，定容后摇匀，作为对照溶液。另取硫酸沙丁胺醇原料药45 mg，置1 000 mL量瓶中，定容后摇匀，作为本底校正溶液。分别进样测定，按外标法以峰面积计算杂质C、D、F、M、O 含量，扣除本底量后计算回收率。杂质C、D、F、M、O回收率分别为99.1%，99.3%、100.1%、100.5%、100.2%，RSD%分别为2.6%、2.1%、2.5%、1.7%、1.9%（n＝9）。

表2 线性关系及定量限与检测限结果

2.9 样品测定［14］取硫酸沙丁胺醇原料药与各有关物质对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液、对照品溶液储备液并进行稀释，分别进样，记录色谱图。供试溶液的色谱图中如出现与对照溶液中相应已知杂质保留时间一致的色谱峰，按外标法计算各有关物质含量，结果见表3。

表3 样品中硫酸沙丁胺醇有关物质检测结果/%

3 讨论

3.1 检测波长的选择采用二极管阵列检测器对硫酸沙丁胺醇及各杂质进行全波长扫描，在本文色谱条件下，由混合对照品溶液PDA图谱结果可知，杂质I在262 nm附近有较强吸收，范围较宽，杂质D在255 nm处有较强吸收，范围较宽，硫酸沙丁胺醇及其他杂质在273 nm左右处有特征吸收峰；综合考虑，确定273 nm作为硫酸沙丁胺醇有关物质的检测波长。

3.2 色谱条件的优化根据图2可知，其中杂质L、M、C 之间分离度较小，根据图1 中杂质的结构式可知，以上三种杂质结构较为相似，其中杂质L极性最大，杂质C 极性最小，在梯度选择时，5～12 min 梯度变化10%，为了保证杂质J 与主成分峰分离，在12～45 min 梯度变化75%，通过较大的极性变化使较难分离的杂质L、M、C达到分离要求，其中L、M、C的出峰顺序符合从极性从大到小的梯度变化。

3.3 杂质分析本实验所使用的原料药外购原料药，由于不了解其具体的合成工艺，无法推断图3的F中保留时间为14.847 min的杂质结构。杂质G为中间体反应过程中还原不完全的副产物，在进行下一步反应时可产生新的杂质，有必要对杂质G进行控制，本方法可检测该杂质，提高反应过程中的质量控制。

3.4 检测方法分析药品不良反应往往与其中杂质相关，杂质研究及控制是药品安全保证的关键要素，在药品研发中具有重要地位。随着药品研究的深入和发展，杂质研究理念已经由杂质控制飞跃至杂质谱控制，杂质谱分析引入到工艺路线的风险评估中，本方法针对硫酸沙丁胺醇工艺路线中可能产生的大部分杂质进行检测，达到多个杂质同时检测的目的，提高效率；与原有检测方法比较，该方法可同时检测杂质数量更多，适用于多种合成方法的杂质研究，更加符合杂质谱分析的理念，对杂质深入研究，建立针对性的分析方法，提高药品质量。

3.5 小结强制降解试验结果表明，硫酸沙丁胺醇原料药在高温、光照条件下较稳定，在强酸碱及氧化条件下发生降解。由使用本方法检测的结果可知，破坏产生的各杂质于硫酸沙丁胺醇均能达到较好分离，方法专属性强，灵敏度高，利于硫酸沙丁胺醇有关物质检测。更好控制原料药的质量，也为制剂的质量控制提供参考。