牛至精油对荧光假单胞菌的抑制作用及其 对冷藏三文鱼品质的影响

杨胜平，章 缜，程 颖，钱韻芳,，谢 晶,

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

三文鱼又称大西洋鲑（Salmo solar），属于硬骨鱼纲鲑形目鲑科鱼类，为冷水域洄游鱼类，主产地是挪威、苏格兰等北半球高纬度地区，其肉色呈鲜艳的橘红色，富含ω-3系不饱和脂肪酸，是国际上流行的名贵食用鱼类[1]。在过去10 年里，我国三文鱼年消费量也逐年增加，如何在加工贮运过程中减少微生物对其品质的影响，也成为了水产品保鲜领域的重要课题之一。在传统三文鱼贮运流程中，低温下冷链物流是一种重要方式，但诸如假单胞菌、单增李斯特菌、嗜冷杆菌等在低温下具有适冷特性的细菌仍能够迅速适应环境并大量代谢繁殖，从而导致鱼肉质的腐败变质[2]。有研究表明，在4 ℃冷链运输条件下荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）数量仍可逐渐增长成为优势菌，且腐败能力强[2]，是冷藏三文鱼的特定腐败菌[3]。微生物侵染会导致三文鱼蛋白质分解、鱼体表面发黏，并产生小分子挥发性氨类物质，形成难闻气味，最终造成腐败[4]。荧光假单胞菌的适冷能力是其能够成为冷藏三文鱼特定腐败菌的关键，这类适冷菌一般都能够通过调节细胞膜流动性来提高低温下细胞膜磷脂双分子层的柔性[5-6]。因此，如何抑制荧光假单胞菌的冷适应能力有望成为研发新型保鲜技术延长水产品货架期的潜在研究方向。

植物精油是从植物中提取的具有芳香气味的挥发性油状液体混合物，一直以来作为香料添加于食品中以起到提高食品风味质量的作用[7]。近年来研究表明，部分精油还具有良好的抑菌活性，其中牛至精油因在改善食品风味和抑菌活性方面都具有良好作用而受到广泛关 注[8]。牛至精油主要是从牛至草的茎和叶中提取而成，主要成分为百里香酚、香芹酚等，其主要作用位点可能是菌体细胞膜[9]。前人研究表明牛至精油对大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、霉菌以及水产品的特定腐败菌荧光假单胞菌、副溶血性弧菌和腐败希瓦氏菌均有较强的抑制作用[10-11]，但关于不同温度，尤其是传统冷藏温度（4 ℃）条件下，牛至精油对腐败菌细胞膜流动性方面的作用还鲜见报道。因此，本实验主要对比研究了在最适生长温度（30 ℃）和传统冷藏温度（4 ℃）条件下，牛至精油对荧光假单胞菌SBW25生长、细胞膜完整性、流动性以及形态的影响，探讨牛至精油对荧光假单胞菌适冷能力的抑制效果，并通过对接种荧光假单胞菌的三文鱼片感官、微生物及理化指标的测定，分析牛至精油在抑制荧光假单胞菌导致的三文鱼腐败进程中的作用，为研究与低温具有协同作用的保鲜方法提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荧光假单胞菌菌株SBW25由本课题组前期从4 ℃冷藏三文鱼肉中分离纯化并经生理生化鉴定，生工生物上海股份有限公司进行16S rRNA测序比对确定菌株，菌株保存于－80 ℃冰箱待用。三文鱼购于上海浦东新区芦潮港海鲜市场，鱼体置于铺满碎冰的冷藏箱内运至实验室；牛至精油（产地：西班牙；萃取部位：叶）购自多特瑞上海贸易有限公司。

脑心浸肉汤、平板计数琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptone soy broth，TSB）培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒 美国Sigma公司；12%电泳预制胶、电泳缓冲液 南京建成生物有限公司；双色预染蛋白Marker、蛋白Loading Buffer 生工生物工程上海（股份）有限公司；十九烷酸甲酯、浓盐酸、甲醇、正己烷、氯仿、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PB LDZX-50KB S蒸汽灭菌器 上海申安公司； VS-1300L-U洁净工作台 苏州苏净泰安集团；H-2050R台式离心机 湖南湘仪仪器有限公司；SHA-2型制冷恒温振荡器 金坛市城西峥嵘实验仪器厂；TDDS-307A 型电导率仪 上海雷磁仪器厂；i M a r k 酶标仪、S-3400N型扫描电子显微镜 日本日立仪器有限公司； K j e l t e c 8 4 0 0 型全自动凯氏定氮仪 丹麦F O S S分析仪器公司；L C-2 0 1 0 C H T 型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、R F-6 0 0 0 荧光分光光度计 日本岛津公司； ZE-2000型色差计 日本尼康公司；TA.XT Plus型质构仪 英国SMS公司；Bag MixerVW型拍打式均质器 南京以马内利仪器设备有限公司；低场核磁共振成像分析仪 上海纽曼科技公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至精油对荧光假单胞菌的抑菌活性分析

1.3.1.1 荧光假单胞菌的活化与培养

取保藏于－80 ℃冰箱中的荧光假单胞菌菌种，经脑心浸肉汤培养基活化18 h后，分别接种1 mL于100 mL TSB培养基中，于30 ℃最适温度下摇床培养12～18 h至菌液浓度达到108CFU/mL，待用。

1.3.1.2 最小抑菌浓度的测定

在牛津杯均匀放置的培养皿中倒入一定量灭过菌的平板计数琼脂培养基，待培养基凝固后，将制备好的菌悬液调整至106～107CFU/mL，吸取500 μL该菌悬液均匀涂布于培养基上；随后小心取出牛津杯，在留下的孔洞中注入200 μL不同体积分数牛至精油；将培养皿放入37 ℃培养箱中恒温培养48 h，测量抑菌圈直径[12]。做3 组平行，根据抑菌圈直径确定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.1.3 荧光假单胞菌抑菌生长曲线的绘制

取1 mL活化好的菌悬液接种于TSB培养液中，30 ℃下摇床培养2 h后加入1、2 倍MIC的牛至精油，以不添加牛至精油处理的样品为对照组，于30 ℃继续摇床培养20 h或4 ℃培养48 h，并用酶标仪每4 h（4 ℃）或每2 h（30 ℃）测定OD595nm。

1.3.1.4 菌液电导率的测定

每隔6 h（4 ℃）或2 h（30 ℃）参照Qian Yunfang等[13]的方法用电导率仪测定电导率。每个样品做3 组平行。

1.3.1.5 AKP活力的测定。

每隔6 h（4 ℃）或每2 h（30 ℃）取菌液，在4 ℃下5 000h g离心取上清液，按照AKP试剂盒说明进行测定，单位为U/100 mL，每个样品做3 组平行。

1.3.1.6 细菌微观结构观察

将待测菌液5 000 r/min离心5 min，取沉淀菌体用50 mmol/L、pH 7.0无菌磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3 次，小心固定于体积分数2.5%戊二醛溶液中6 h，后分别经体积分数30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水自然风干后粘至金属箔片上喷金，于扫描电子显微镜下观察形态结构变化[14]。

1.3.1.7 荧光假单胞菌膜流动性的测定

参照He Jing等[15]的方法，将分别在30 ℃和4 ℃条件下经过MIC牛至精油处理的荧光假单胞菌菌液4 ℃、5 000hg离心收集菌体，用PBS（50 mmol/L、pH 7.0）冲洗3 次后，重悬于含0.5 mmol/L的二硫苏糖醇和0.1% Tween 20的PBS（50 mmol/L、pH 7.0）中。在4 ℃下手动研磨10 min后离心（10 000hg、20 min），弃沉淀，对上清液进行蛋白质量浓度测定并于－40 ℃下保存待用。ANS母液（5 mmol/L）由Tris-HCl缓冲液配制而成，使用前稀释至1.0h 10－4mol/L。用上述PBS稀释样品使蛋白质终质量浓度为5 mg/L、ANS终浓度为10 μmol/L后，在室温下静置20 min，然后4 ℃、5 000hg离心，弃去上清液，蛋白质沉淀重悬于PBS中，重复洗涤2 次后用荧光分光光度计测定其ANS荧光强度。荧光条件：激发波长385 nm，发射波长480 nm。

1.3.2 牛至精油对接种假单胞菌三文鱼的品质影响分析

1.3.2.1 样品处理

将活化好的荧光假单胞菌菌液稀释至105CFU/mL后接种于杀菌鱼肉[16]，其中一组于提前配制好的体积分数0.0625%（MIC）牛至精油浸泡60 s，以接种了荧光假单胞菌但未用牛至精油浸泡为对照组。然后将处理好的鱼块放置于4 ℃条件下冷藏12 d，每隔1 d取样检测各项指标。

1.3.2.2 感官评定

样品放置于无菌白色托盘中，根据Sallam[17]的感官评分标准，选取5 名具有感官评定经验的人员分别从气味、肌肉组织和体表色泽3 个方面进行综合评分。分数按降序排列，其中10～9 分为优秀，8～7 分为好，6～5 分为可接受，4～3 分为品质差，2～1 分为品质极差。评定小组成员均已事先熟悉评级标准。

1.3.2.3 菌落总数的测定

参照Gómez-Estaca等[18]的方法测定菌落总数。

1.3.2.4 挥发性盐基氮含量的测定

称取5 g左右的剁碎鱼肉，与约0.5 g轻质氧化镁加入消化管中，使用凯氏定氮仪测定总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[19]。

1.3.2.5 生物胺含量的测定

按照Qian Yunfang等[20]的方法，使用HPLC法测定生物胺含量。

1.3.2.6 自由水相对含量的测定

参照Wang Shuo等[21]的方法，采用低场核磁共振成像分析仪测定横向弛豫时间T2。取体积约为1 cm3大小的鱼块，放入核磁管中进行测定。首先根据样品在设置中选择测量参数，确定中心频率，检测之后进行数据反演，得到T2的分布情况。

1.4 数据统计与处理

所有处理做3 个平行，Excel 2010软件记录相关实验结果，运用SPSS 19.0软件进行方差分析和数据间的平均值比较，用Origin 9.0软件绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 牛至精油对荧光假单胞菌的抑菌活性分析结果

2.1.1 牛至精油对荧光假单胞菌MIC的确定

MIC是一种验证保鲜剂抗菌活性的有效指标，具体指保鲜剂对目标菌株产生抑制作用时所需的最低浓度，常利用测定抑菌圈直径的方法来确定[22]。由表1可知，抑菌圈直径与牛至精油体积分数呈现正相关增长，与赵海伊等的研究结果[23]相一致。当牛至精油体积分数达0.062 5% 时，抑菌圈直径为（8.12f 0.27）mm，此时荧光假单胞菌对牛至精油达到低敏感度，表明此时牛至精油开始对荧光假单胞菌SBW25产生较明显的抑制作用。由此可确定MIC为0.062 5%。

表 1 牛至精油作用于荧光假单胞菌的MICTable 1 MIC of oregano oil on Pseudomonas fluorescens

2.1.2 牛至精油对假单胞菌生长曲线的影响

由图1可看出，30 ℃下经MIC牛至精油处理的荧光假单胞菌，在培养的前5 h内有一定的增长，之后增长则受到抑制，无明显对数期；与对照组相比，MIC、2 MIC牛至精油处理组荧光假单胞菌总体增长较慢，说明其生长被抑制。4 ℃下实验组与对照组荧光假单胞菌生长趋势与30 ℃相似，说明在低温下牛至精油也具有抑制荧光假单胞菌SBW25生长繁殖的能力。但4 ℃下，培养末期的OD595nm略高于30 ℃相应组别，这可能与低温下细菌细胞个体体积偏大，导致色散程度增强有关。Friedman等[24]利用混合了大蒜汁和牛至油的牛至叶提取物处理大肠杆菌及芽孢杆菌，发现60 min时可减少50%微生物数量；并进一步研究了不同温度下抑菌能力（37、21 ℃及4 ℃），其结果与本研究较一致。

图 1 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下对荧光假单胞菌 生长曲线的影响Fig. 1 Effect of oregano essential oil on the growth curves of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

2.1.3 牛至精油对假单胞菌菌液电导率的影响

图 2 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下对荧光 假单胞菌电导率的影响Fig. 2 Effect of oregano essential oil on electrical conductivity of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

细菌的细胞膜具有稳定胞内离子浓度的功能，如果细胞膜结构受到破坏，细胞内的电解质会以离子的形式渗出胞外，导致菌液电导率的变化[25]。因此，通过测定菌液电导率的变化可知细胞膜通透性的变化。如图2所示，各组假单胞菌菌液电导率均随培养时间延长而增加，但牛至精油处理组比对照组上升速率更快，相同培养时间时，其电导率明显高于对照组，可能是由于牛至精油中香芹酚及百里香酚影响了荧光假单胞菌细胞膜阴阳离子，改变了离子梯度；且精油体积分数越高，菌液电导率越高，这与谢强等[26]对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的研究结果一致。对于两个牛至精油处理组，低温条件下的电导率均低于高温条件下的电导率，这可能与低温下精油有效成分扩散较慢有关。

2.1.4 牛至精油对假单胞菌液中AKP活力的影响

图 3 牛至精油在30 ℃（A）及4 ℃（B）下对荧光假单胞菌 AKP活力的影响Fig. 3 Effect of oregano essential on AKPase activity of Pseudomonas fluorescens at 30 (A) and 4 ℃ (B)

AKP在生物体内细胞物质代谢中有着重要的作用。荧光假单胞菌的细胞膜受到破坏会导致AKP渗出到细胞外，引起菌液中AKP活力的变化。如图3所示，牛至精油处理组和对照组的AKP活力均随着培养时间延长呈总体上升的趋势，且牛至精油处理组AKP活力明显高于对照组。30 ℃条件下，添加牛至精油组菌液中AKP活力先急速上升，随后逐渐趋于稳定增长；低温下存在同样趋势，且培养末期MIC组AKP活力与30 ℃下的相近。4 ℃条件下，2 MIC牛至精油组AKP活力在12 h内增至2.31 U/100 mL，增速慢于30 ℃实验组。这可能因为低温下精油有效成分扩散较慢，部分荧光假单胞菌膜通透性在一定时间仍能保持完整，AKP未能渗出至胞外。

2.1.5 牛至精油对菌假单胞菌菌体超微结构的影响

如图4所示，30 ℃和4 ℃下对照组荧光假单胞菌均呈具有光滑细胞膜的正常形态。经MIC牛至精油作用后，菌体在形态上发生了较大的改变，细胞表面褶皱、凹陷，失去了原有的细胞形态，表明细胞膜被破坏。牛至精油处理组菌体在30 ℃下有黏聚现象发生，且菌体变小，细胞破裂形成细胞碎片，细胞褶皱下凹而畸形；4 ℃下则能明显观察到细胞膜粗糙且附有颗粒，这与Oussalah等[27]的研究结果一致。由此推测，牛至精油可能是作用于细胞膜（如蛋白质和脂质）。Tyagi等[28]利用扫描电子显微镜和原子力显微镜等仪器同样观察到另一种植物精油柠檬草精油及其蒸气对大肠杆菌形态结构损伤，与本研究结果相似。

图 4 30 ℃（A）及4 ℃（B）下经牛至精油作用的荧光 假单胞菌扫描电子显微镜图Fig. 4 Scanning electron micrographs of Pseudomonas fluorescens treated with oregano essential oil at MIC at 30 (A) and 4 ℃ (B)

2.1.6 牛至精油对假单胞菌膜流动性的影响

图 5 牛至精油在30 ℃及4 ℃下对荧光假单胞菌膜荧光光谱的影响Fig. 5 Effect of oregano essential on the fluorescence spectrum of ANS-labeled membrane in Pseudomonas fluorescens at 30 and 4 ℃

一般而言，低温下，细菌细胞膜脂肪酸链逐渐形成规则排列的晶型，从而发生凝固，导致细胞膜流动性下降，但嗜冷菌能够通过改变细胞膜脂肪酸组成维持一定的细胞膜流动性，以保持细胞膜的生理功能。因此，细胞膜流动性的变化能够在一定程度上反映牛至精油对细菌冷适应能力的影响。荧光强度的大小可反映细胞膜的流动性，一般来说荧光强度越大则细胞膜流动性越差。如图5所示，两个温度条件下，对照组荧光强度均低于MIC牛至精油组，表明对照组细胞膜流动性最好，添加牛至精油后膜流动性降低。这可能是因为有机溶剂精油使细胞膜上形成孔道，导致小分子物质从膜内渗出；同时精油进入疏水区会改变细胞膜中脂肪酸组分，从而影响细胞膜的流动性。对于相同处理组，4 ℃下荧光假单胞菌细胞膜的荧光强度明显高于30 ℃，表明低温能够降低细胞膜的流动性，进一步说明牛至精油在低温条件下具有增效作用。Siroli等[29]研究发现，牛至精油可以诱导部分与单增李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌细胞膜相关的脂肪酸组成发生转变，具体表现为不饱和脂肪酸、反式异构脂肪酸和特定游离脂肪酸的变化，表明牛至精油可以影响细胞膜流动性。

2.2 牛至精油对接种假单胞菌三文鱼贮藏过程中品质的影响

2.2.1 感官评定

表 2 牛至精油对三文鱼4 ℃贮藏过程中的感官评分结果Table 2 Sensory evaluation scores of salmon during storage at 4 ℃

如表2所示，随着贮藏时间的延长，对照组和牛至精油处理组感官评分都出现显著下降；对照组在贮藏第6天时已达到4 分左右，处于感官不可接受范围，在第8天出现明显的腐臭味；牛至精油处理组感官评分在前期缓慢下降，在第8天时仍有5.33 分，仍处于可接受范围内，到第10天才低于5 分，达到感官不可接受范围。从感官方面的判断，牛至精油有效地改善了三文鱼的感官品质，可使三文鱼感官可接受度货架期从对照组的6 d延长至8 d，可将货架期延长2 d。这与van Haute等[30]的研究结果一致，即添加精油可以有效抑制接种的荧光假单胞菌增殖，减缓三文鱼和猪肉的腐败变质。

2.2.2 菌落总数

图 6 牛至精油对三文鱼贮藏过程中菌落总数的影响Fig. 6 Effect of oregano essential oil on total viable count of salmon during storage

微生物数量是影响鱼类货架期的主要因素，是衡量鱼肉新鲜程度的主要标准，如图6所示，牛至精油处理组和对照组的菌落总数随着贮藏时间延长均总体呈上升趋势，且处理组菌落总数增速明显小于对照组。与对照组相比，牛至精油处理组菌落总数在前4 d增长缓慢，这可能因为牛至精油作用于荧光假单胞菌细胞膜，起到了抑菌作用，这与体外抑菌的结果类似。贮藏末期牛至精油处理组菌落数未超过对照组，说明MIC牛至精油处理能够较好地抑制冷藏鱼肉中假单胞菌的生长。贮藏12 d后，牛至精油处理组菌落总数较对照组低 1.34（lg（CFU/g））。

2.2.3 TVB-N含量

图 7 牛至精油对三文鱼贮藏过程中TVB-N含量的影响Fig. 7 Effect of oregano essential oil on TVB-N content of salmon during storage

三文鱼富含的蛋白质、氨基酸等营养物质极易被分解产生氨等碱性挥发性物质，TVB-N含量是评价三文鱼的新鲜度的重要指标。如图7所示，贮藏过程中，牛至精油处理组鱼肉TVB-N含量始终低于对照组，对照组在第6天时TVB-N含量为24.43 mg/100 g，处理组在第12天时TVB-N含量为27.66 mg/100 g，这是因为牛至精油能抑制微生物生长繁殖，减缓蛋白质的分解。Dolea等[31]研究发现，牛至精油能缓解三文鱼海藻汉堡的TVB-N和三甲胺氮含量的增加，并具有较好的抗氧化性。贮藏12 d后，处理组TVB-N含量比对照组低7.48 mg/100 g。

2.2.4 生物胺含量

图 8 牛至精油对三文鱼贮藏过程中腐胺（A）和尸胺（B）含量的影响Fig. 8 Effect of oregano essential oil on putrescine (A) and cadaverine(B) contents of salmon during storage

腐胺和尸胺是三文鱼低温贮存中含量变化较为明显的生物胺。由图8可以看出，4 ℃贮藏初期（0～2 d），对照组和牛至精油处理组的腐胺和尸胺含量并未出现明显差异。2 d之后，经MIC牛至精油处理的鱼肉生物胺含量增长受到明显抑制，直至贮藏结束，牛至精油处理组腐胺和尸胺含量均低于对照组。第8天时，对照组腐胺、尸胺含量分别为68.18、45.41 mg/kg，牛至精油处理组则仅为35.14、30.21 mg/kg，分别比对照组低48.5%和33.5%。说明牛至精油对荧光假单胞菌有着明显的抑制作用，能减缓其对鱼肉的降解作用，这与Huang Zhan等[32]关于桂皮精油的研究结果一致。

2.2.5 低场核磁共振自由水分析结果

图 9 牛至精油对三文鱼贮藏过程中自由水峰面积比例的影响Fig. 9 Effect of oregano essential oil on peak area ratio of free water in salmon during storage

自由水峰面积的比例能反映自由水相对含量。 由图9可知，在4 ℃下，随着贮藏时间的延长，自由水相对含量呈现上升趋势，这表明鱼肉中肌原纤维内的水不断减少，不易流动水逐渐向外流失，并以自由水的形态存在[33]。整个贮藏期内牛至精油处理组自由水相对含量的变化趋势较对照组更平缓，说明经牛至精油处理的鱼肉可能具有更好的持水力，水分损失更少。 刘楠等[34]采用低场核磁共振技术研究了经迷迭香、葡萄籽提取物复合保鲜剂处理后，鱼丸贮藏过程中的横向弛豫时间T2，结果显示复合保鲜剂可有效减少鱼丸自由水的生成，与本研究结果一致。

3 结 论

牛至精油作用于荧光假单胞菌时的MIC为0.062 5%；体外抑菌实验表明，牛至精油在30 ℃和4 ℃条件下均表现出了较好抑菌效果，经牛至精油处理的荧光假单胞菌，扫描电子显微镜显示细胞膜破坏明显，细胞膜荧光强度变化表明其流动性下降，且电导率及AKP活力均高于对照组，表明牛至精油通过破坏细胞膜、降低细胞膜流动性有效抑制了假单胞的生长代谢。

在4 ℃低温贮藏过程中，与对照相比，MIC牛至精油处理可有效抑制接种有荧光假单胞菌的三文鱼菌落总数的增长，延缓三文鱼肉在低温贮藏下的品质劣变，减少鱼肉中自由水的流失和TVB-N、生物胺产量，其能有效抑制冷藏三文鱼特定腐败菌荧光假单胞菌的致腐败能力，延长了接菌三文鱼肉低温下的货架期。本研究为冷藏三文鱼的保鲜方法研发提供了一定的理论与实践依据。