虎杖苷通过激活Nrf2/HO-1信号抑制氧化应激诱导的心肌细胞损伤

毕静 白晓雪 王超

(1湖北省阳新县人民医院心内科，湖北 阳新 435200；2吉林大学第一医院干部病房；3淄博市第一医院中医科)

虎杖苷是从传统中药虎杖的根中提取的白藜芦醇的天然前体，具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎活性〔1～5〕。虎杖苷已被证明可以保护心肌细胞免受急性心肌梗死引起的心肌细胞损伤〔6〕。在大鼠冠状动脉结扎模型中，它也能减轻心肌梗死后的微囊重构。也有研究表明虎杖苷抑制了肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活化和过氧化〔7〕，但其作用机制尚未阐明。核因子 E2 相关因子(Nrf)2是一种氧化应激的调节因子，能调节编码抗氧化蛋白表达，抑制氧化应激反应，血红素加氧酶(HO)-1 基因是 Nrf2 的依赖基因，其产物是一种强效的抗氧化剂〔8,9〕。本研究旨在探讨虎杖苷对心肌的保护作用及是否通过Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。

1 材料与方法

1.1材料 H9c2鼠胚胎心肌细胞细胞(长沙维尔生物科技有限公司)，Nrf2 ，HO-1，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，抗B淋巴细胞癌(Bcl)-2，Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体，辣根过氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(英国Abcam公司)。DMEM培养基及胎牛血清(美国HyClone公司)，噻唑蓝(MTT)试剂盒、过氧化氢(H2O2)、虎杖苷(美国Sigma公司)，ML385(美国TargetMol公司)，核蛋白抽提试剂盒，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒及丙二醛(MDA)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养和H2O2诱导的细胞损伤模型建立 H9c2加入DMEM 高糖培养基(含10%胎牛血清)，在含5%CO2饱和湿度的37℃恒温培养箱中培养，2～3 d换液1次。H9c2细胞接种于96孔板中，细胞密度为每孔有104个细胞。培养过夜后分别用不同剂量H2O2(0、100和200 μmol/L)孵育细胞1 h。采用MTT法测定细胞存活率。细胞用MTT溶液在DMEM(0.5 mg/ml)中溶解4 h。弃去上清，在每孔中加入150 μl DMSO来溶解沉淀物。酶标仪检测波长492 nm每孔的吸光度。

1.2.2细胞生存能力分析 细胞按上述方法接种，在H2O2处理前，分别用不同剂量虎杖苷(0，10，100，250和500 μmol/L)处理6 h。MTT检测细胞存活率。

1.2.3细胞分组 将细胞分为正常组、H2O2诱导模型组(H2O2组)、虎杖苷处理组(H2O2+虎杖苷)、虎杖苷+DMSO组(H2O2+虎杖苷+DMSO)及虎杖苷+ML385组(H2O2+虎杖苷+ML385)。待细胞进入对数生长期后，虎杖苷处理组(100 μmol/L虎杖苷)、虎杖苷+DMSO(100 μmol/L虎杖苷+0.2%DMSO)组及虎杖苷+ML385(100 μmol/L虎杖苷+3 μmol/L ML385)组分别进行处理，在DMEM中培养6 h后100 μmol/L H2O2处理1 h。

1.2.4Western印迹分析 使用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取蛋白，并应用核蛋白抽提试剂盒提取和核蛋白。采用BCA法测定蛋白质浓度。加入上样缓冲液后，取30 μg每孔上样，用10%十二烷基硫代硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行蛋白电泳。转膜后用5%无脂乳封闭膜2 h，用Nrf2 (1∶3 000)，HO-1(1∶2 000)，GAPDH(1∶10 000)，Bax (1∶1 000)，Bcl-2 (1∶1 000)在4℃下过夜孵育，用TBST洗3次。然后孵育HRP标记的相应二抗(羊抗兔1∶3 000)，在室温下孵育1 h后ECL显色。

1.2.5检测细胞上清中SOD和MDA水平 细胞培养上清液4℃、3 000 r/min离心 10 min，分别使用试剂盒检测SOD和MDA 水平。具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3统计分析 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1H2O2的最适浓度 用不同剂量H2O2(0、50、100和200 μmol/L)孵育细胞1 h后，H2O2的诱导能剂量依赖性地降低细胞的生存能力。未刺激组(即H2O2浓度为0 μmol/L)细胞活力为1，当用100和200 μmol/L H2O2孵育细胞后，细胞活力分别为0.50±0.10，0.37±0.03，明显低于未刺激组(P< 0.01)。100 μmol/L H2O2使细胞存活率下降约50%。因此，选择100 μmol/L 的H2O2进行诱导。

2.2对细胞存活率的影响 在H2O2处理前，分别用0，10，100，250和500 μmol/L虎杖苷处理6 h，细胞活力分别为0.58±0.08，0.72±0.05，0.89±0.09，0.90±0.07和0.88±0.05，表明虎杖苷处理可剂量依赖性改善H2O2诱导的细胞活力降低，最适浓度为100 μmol/L。

2.3虎杖苷抑制H9c2细胞凋亡 对不同组分别处理6 h后给予H2O2诱导H9c2细胞凋亡。分别提取蛋白后进行Western印迹法检测Bax 和Bcl-2的表达，结果显示，虎杖苷能逆转H2O2诱导的Bax降低，并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而同时给予ML385则削弱了虎杖苷的抗细胞凋亡作用，见表1，图1。

表1 虎杖苷对H9c2细胞Bcl-2和Bax表达的影响

与正常组比较：1)P<0.05；与H2O2组比较：2)P<0.05；与虎杖苷+ML385组比较：3)P<0.05，下表同

1～5：正常组,H2O2组,虎杖苷处理组，虎杖苷+DMSO组，虎杖苷+ML385组，下图同图1 各组细胞中Bax及Bcl-2的表达

2.4虎杖苷促进Nrf2和HO-1蛋白的表达 Western印迹法检测Nrf2和HO-1蛋白的表达水平，结果显示，虎杖苷处理后核内Nrf2水平升高，同时HO-1蛋白的表达水平升高。同时给予Nrf2拮抗剂ML385后Nrf2和HO-1蛋白的表达水平升高受到了抑制，见表2，图2。

2.5虎杖苷抑制H2O2诱导的过氧化反应 检测细胞培养上清液中SOD及MDA的水平，结果显示，与H2O2组比较，虎杖苷降低了H2O2诱导的SOD 水平显著升高。同时上调被H2O2降低的MDA水平，同时给予ML385后，减弱了SOD的下降和MDA水平的升高，见表3。

表2 虎杖苷对H9c2细胞Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

图2 各组细胞中Nrf2和HO-1的表达

组别SOD(mmol/L)MDA(U/L)正常组31.0±1.57.30±1.8H2O2组25.6±2.31)18.20±2.41)虎杖苷组37.1±4.22)3)13.50±3.22)3)虎杖苷+DMSO组36.2±3.22)3)12.62±2.82)3)虎杖苷+ML385组27.0±2.818.42±1.9

3 讨 论

虽然早期溶栓、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术降低了急性心肌梗死的死亡率。急性心肌梗死仍然是全世界死亡和残疾的主要原因〔10〕，急性心肌梗死后，患者不可避免地经历由氧化应激和心肌细胞凋亡介导的左心室重构，而抑制氧化应激和心肌细胞凋亡可能会降低急性心肌梗死后的重构程度〔11,12〕。虎杖苷是中药虎杖的主要成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等活性。

本研究首先建立了H2O2诱导的细胞凋亡模型，确定了H2O2的刺激浓度，当浓度为100 μmol/L时可使细胞存活率下降约50%。并通过MTT检测证明虎杖苷能剂量依赖性改善H2O2诱导的细胞活力的降低。通过Western印迹法检测可以发现在虎杖苷治疗下，细胞凋亡得到抑制。同时应用Nrf2抑制剂ML385对细胞进行处理，可见细胞凋亡程度加重，考虑虎杖苷的抗凋亡作用可能与Nrf2及其下游HO-1的表达有关。通过Western印迹法检测了HO-1及核内Nrf2的表达。发现虎杖苷明显上调Nrf2的入核作用，进而促进了HO-1的表达。给予ML385后Nrf2的上调得到抑制，同时其介导的HO-1的表达下降。而H2O2刺激下，细胞培养上清液中MDA 水平明显增加，这是脂质过氧化作用的最终产物，同时，抗氧化酶 SOD活性降低，虎杖苷明显改善了上述变化。而抑制Nrf2后，虎杖苷的抗氧化作用也被抑制，考虑虎杖苷的抗氧化作用是通过促进Nrf2及其下游HO-1的表达而介导的。总之，虎杖苷能抑制H2O2诱导的细胞活性的下降和细胞凋亡，其机制可能为上调Nrf2，从而促进HO-1表达，进而抑制氧化应激。