右归丸对膝骨关节炎模型鼠软骨组织显微结构及热休克蛋白90α蛋白表达的影响*

安方玉，颜春鲁△，刘永琦，王继龙，赵 磊， 夏鹏飞，骆亚莉，王国文，赵崇博，邓 婕

[1甘肃中医药大学, 2甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室, 3甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室, 4敦煌医学与转化教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730000]

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以膝骨关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生为特征的慢性关节炎疾病[1]，在疾病的活动期成为中老年人群发生疼痛和致残的主要原因。目前治疗KOA的首选药物主要是镇痛药:非甾体抗炎药和皮质类固醇类药物。非甾体抗炎药和皮质类固醇类药物虽然起效快，但是长期服用非甾体抗炎药和皮质类固醇类药物只能缓解症状，并不能阻止关节软骨破坏的进展，并且不良反应较大，为此，寻找安全、低毒、有效的药物成为防治KOA的关注焦点。中医认为，KOA属于 “痹证”和“痿证”，肝肾亏虚、长期劳损及外感风寒湿邪是其主要病机。右归丸(Youguiwan,YGW)具有温补肾阳和填精止遗的功效，针对KOA的肝肾亏虚之症，本方对KOA可能具有疗效。本实验通过复制膝骨性关节炎实验性动物模型，以中药右归丸灌胃，观察其对模型鼠膝骨性关节炎关节软骨的病理及热休克蛋白90α(heat shock protein 90α，Hsp90α)、纤连蛋白(fibronectin，Fn)蛋白和Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ)等相关蛋白表达的影响，分析中医药防治KOA的机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重(180±20) g，购自我校科研实验动物饲养中心。动物质量合格证号为SYXK(甘)2015-0005。

2 主要试剂

水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号：20150105)；反转录试剂2×Prime Script RT Master Mix(大连宝生物工程有限公司，批号： AI20775A)； 荧光定量SYBR Premix EX TaqⅡ(Promega，批号为：0000304040)。β-actin、白细胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)、基质金属蛋白酶3 (matrix metalloprotei-nase-3, MMP-3)和MMP-13的RT-qPCR引物序列由TaKaRa设计并合成。β-actin的上游引物序列为5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列为5’-GACTCATCGTACTCCGCTTGCTG-3’，扩增产物150 bp； IL-1β的上游引物序列为5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游引物序列为5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’，扩增产物为111 bp；MMP-3的上游引物序列为5’-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3’，下游引物序列为5’-TTCATGAGCAG CAACCAGGAATAG-3’，扩增产物为136 bp；MMP-13的上游引物序列为5’-TGATGATGAAACCTGGACAAGCA-3’，下游引物序列为5’-GAACGTCATCATCTGGGAGCA-3’，扩增产物为173 bp。抗GAPDH抗体(ImmunoWay，批号：B4501)； rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody(Gene Tex，批号：821801317)； rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody(Gene Tex，批号：821801325)； rabbit anti-Fn polyclonal antibody(Gene Tex，批号：821801378)。

3 主要仪器

BioMATE 3S型蛋白和核酸浓度测定仪(Thermo)； BX53型显微镜(OLYMPUS)；C1000型PCR热循环仪(ABI)；LightCycler 96型 Real-Time PCR System(Roche)；ChemiDocTMXRS+型凝胶成像分析系统(Bio-Rad)；TGL16M型台式高速冷冻离心机(凯达集团成员高科技公司)；OSE-Y10型电动组织研磨器(Tiangen)。

4 实验药物及给药剂量

右归丸购自仲景宛西制药股份有限公司(国药准字Z41022170，批号：151108)，人的临床用量为27 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法，27 g×0.018×5≈2.4 g/kg，作为中剂量，则右归丸高、中、低剂量分别为4.8、2.4和1.2 g/kg；硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate， GS)片(保节力，新兴同仁药业有限公司，国药准字H20041317，批号：160302)；青霉素(北制药股份有限公司，国药准字H13020657，批号：F6042103)。

5 实验方法

5.1动物分组、造模及给药 60 只 SD 大鼠适应性饲养 1 周后，随机分为6组，分别为假手术对照(sham control,SC)组、模型(model,M)组、GS组及右归丸高剂量(YGW-H)组、右归丸中剂量(YGW-M)组和右归丸低剂量(YGW-L)组，每组10只。参照文献[2-3]，首先用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各组动物，模型组及干预组采用改良Hulth 法复制KOA模型，假手术组 SD 大鼠从膝关节内侧只打开关节腔，不破坏韧带和半月板，并保留关节软骨面。术后连续 3 d每天肌肉注射青霉素2×105U，各组大鼠均在相同条件下，自由饮水，摄食。手术造模 6 周后通过HE染色观察软骨细胞的形态变化以判定模型的是否成功，造模成功后给予药物干预，硫酸氨基葡萄糖组灌服硫酸氨基葡萄糖(0. 17 g/kg)，右归丸高、中、低剂量组分别按 4.8、2.4和1.2 g/kg灌服相应的药物，干预 8周。用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各组动物后股动脉采血处死各组动物，摘取双侧膝关节，左侧膝关节固定于4%多聚甲醛，右侧膝关节于-80 ℃冰箱保存备用。

5.2HE染色观察骨形态学变化 动物处死后取完整膝关节，对左侧膝关节脱钙处理并脱蜡至水，采用石蜡包埋法制作蜡块，并用切片机切片，切片厚度约5 μm，HE染色，封片、镜检并进行 Mankin 评分，具体评分标准参考文献[4]进行。评分标准为：软骨结构如常，软骨细胞数量如常，基质染色正常，潮线比较完整记为0分；软骨表面有不规则裂隙，软骨细胞数量弥漫性增多，基质染色减退，出现多重潮线记为1分；软骨裂隙深达肌层，软骨细胞成簇生长，基质染色明显减退，软骨下血管浸入肌层记为2分；软骨裂隙深达辐射层，软骨细胞数量明显减少，基质染色明显减退记为3分；软骨裂隙深达钙化层，基质染色完全消失记为4分；软骨层脱落记为5分。

5.3免疫组化法观察软骨组织Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ的蛋白表达 4%多聚甲醛固定膝关节软骨并脱钙，将石蜡切片进行脱蜡、脱水后将切片放入配制好的枸橼酸缓冲液盒中进行微波修复；3%H2O2室温孵育30 min； 5%山羊血清封闭 30 min；滴加50 μL 的Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ polyclonal antibody(这些I抗的稀释比例分别为1 ∶100、1 ∶100和1 ∶300)，同时用PBS 缓冲液代替I抗设立阴性对照，将切片放入湿盒中，4 ℃过夜；滴加山羊抗兔的 II 抗，室温下放置30 min；滴加ABC工作液，37 ℃孵育60 min；DAB显色；苏木精复染；二甲苯透明，封固。染色以软骨基质表层和中层的软骨细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色，由我校病理教研室老师采用双盲法进行阅片。应用 Image-Pro Plus 6.0 全自动图像分析系统对软骨细胞阳性染色的积分吸光度(integral absorbance,IA) 进行定量分析，对进行标记，以其中一个具有代表意义阳性结果的视野的棕黄色颗粒为标准,自动检测所有视野的阳性结果[4]。

5.4软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表达测定 用 RNA抽提试剂提取软骨组织RNA，BioMATE 3S型蛋白、核酸浓度测定仪测定 RNA 含量。用Promega 试剂盒说明书步骤合成 cDNA第1链，按Promega实时荧光定量试剂盒操作说明书进行PCR。反应条件为：预变性 95 ℃ 2 min；变性 95 ℃ 15 s、退火 58 ℃ 45 s、延伸 60 ℃ 1 min，共45个循环。每个样品各重复 3 次，数据经 2-ΔΔCt处理后进行IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA相对表达量分析。

5.5Western blot法测定软骨组织Hsp90α和COL-Ⅱ的蛋白表达 软骨组织蛋白质的提取用 RIPA 裂解液，蛋白质含量的测定用BCA 法，并调整点样的蛋白质浓度为5 g/L，每孔10 μL，进行SDS-PAGE，转膜，封闭，滴加抗rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody和rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody等 I 抗孵育，滴加山羊抗兔IgG II抗孵育。采用 ECL Plus 超敏发光液染色观察，将溶液A 和 B 等体积混匀后，按约0.125 mL/cm2膜面积进行染色，室温反应1 min后置于 Image Lab 3.0 进行曝光，曝光条件为：单个曝光时间10 s，总曝光时间60 s。

6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析，实验数据结果用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 膝关节软骨组织的形态学观察

HE染色结果显示，假手术组大鼠关节面及滑膜结构完整，软骨细胞呈水平排列，关节软骨边缘光滑；模型组大鼠关节软骨边缘严重破坏，软骨细胞排列紊乱；右归丸低、中剂量组关节软骨边缘不平整，软骨细胞排列紊乱； 右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠软骨结构趋于正常，软骨细胞分布偶见不均，关节软骨表面欠光滑,见图1。Mankin评分结果显示，与假手术组比较，模型组及各干预组大鼠Mankin评分均升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组大鼠Mankin评分均降低(P<0.05或P<0.01),见图2。

Figure 1. The pathomorphological changes of cartilages in each group (HE staining, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
图1 各组大鼠软骨组织病理形态学变化

Figure 2. Comparison of Makin scores in each group. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsSC group;*P<0.05,**P<0.01vsM group.
图2 各组大鼠Makin评分结果的比较

2 软骨组织Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白表达的变化

染色以软骨基质表层和中层的软骨细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。假手术组 Hsp90α呈弱阳性表达，Fn和COL-Ⅱ均呈阳性表达；模型组关节软骨中 Hsp90α强阳性表达，Fn和COL-Ⅱ均呈弱阳性表达；右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组Hsp90α弱阳性表达、Fn强阳性表达，右归丸中、高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组COL-Ⅱ呈强阳性表达。与假手术组比较，模型组大鼠Fn和COL-Ⅱ蛋白表达明显降低，Hsp90α蛋白表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸高剂量组和硫酸氨基葡萄糖组Hsp90α蛋白表达明显降低、Fn蛋白表达明显升高，而右归丸中、高剂量组和氨基葡萄糖组COL-Ⅱ蛋白表达均明显升高(P<0.01),见图3～5和表1。

Figure 3. The cells with positive expression of Hsp90α protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
图3 各组大鼠Hsp90α蛋白的阳性细胞表达结果

Figure 4. The cells with positive expression of Fn protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
图4 各组大鼠Fn蛋白的阳性细胞表达结果

Figure 5. The cells with positive expression of COL-Ⅱprotein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
图5 各组大鼠COL-Ⅱ蛋白的阳性细胞表达结果

表1 各组大鼠Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白免疫组织化学染色阳性表达IA值的结果比较
Table 1.IAvalues for the protein expression of Hsp90α, Fn and COL-Ⅱin each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αFnCOL-ⅡSC56×103174×103 35×103 M203×103##41×103##17×103##GS71×103∗∗135×103∗∗39×103∗∗YGW-H54×103∗∗151×103∗∗44×103∗∗YGW-M189×103 61×103 36×103∗∗YGW-L193×103 52×103 18×103

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

3 软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表达的变化

与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸各干预组和硫酸氨基葡萄糖组IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表达均显著降低(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表达的比较
Table 2. The mRNA expression of IL-1β, MMP-3 and MMP-13 in each group (Mean±SD.n=6)

GroupIL-1βMMP-3MMP-13SC1.00±0.091.00±0.091.00±0.03M7.50±0.23##5.57±0.04##6.18±0.01##GS3.86±0.11∗∗1.27±0.08∗∗2.74±0.06∗∗YGW-H2.56±0.35∗∗1.12±0.10∗∗2.53±0.06∗∗YGW-M4.71±0.15∗∗2.44±0.03∗∗3.18±0.04∗∗YGW-L5.32±0.49∗∗3.62±0.04∗∗4.03±0.09∗∗

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

4 软骨组织Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表达的变化

与假手术组比较，模型组大鼠软骨组织COL-Ⅱ蛋白表达明显降低，Hsp90α的蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，右归丸高剂量干预组和硫酸氨基葡萄糖干预组Hsp90α的蛋白表达显著降低，右归丸中、高剂量干预组和硫酸氨基葡萄糖干预组COL-Ⅱ蛋白表达明显升高(P<0.05),见图6和表3。

Figure 6. Protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in cartilaginous tissues of each group. A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
图6 各组大鼠软骨组织Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白的表达

表3 各组大鼠Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表达的结果的比较
Table 3. The protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αCOL-ⅡSC0.48±0.011.26±0.04M1.01±0.03##0.41±0.05##GS0.58±0.01∗0.73±0.02∗YGW-H0.63±0.03∗0.63±0.05∗YGW-M0.92±0.010.59±0.02∗YGW-L0.75±0.020.38±0.02

##P<0.01vsSC group;*P<0.05vsM group.

讨 论

KOA是一种累及膝关节软骨组织、以疼痛和骨关节退变为主要病理特点的慢性进展性疾病。KOA在祖国医学中属于“骨痹”范畴，主要病机为本虚标实、本痿标痹；因肝藏血，血养筋，故肝之合筋也；肾主贮藏精气，骨髓生于精气，故肾之合骨也。中年以后肝肾亏虚，肝虚则血不养筋，肾虚则髓减，精血不足，筋骨失养，腠理空虚，易感风寒湿之邪而为痹；中医治疗多以补益肝肾为主要法则[5]。来自《景岳全书》的补肾方药右归丸，主要由“熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、附子、肉桂、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归”组成，方中附子、肉桂、鹿角胶培补肾中元阳，温里祛寒，为君药。熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药滋阴益肾，养肝补脾，填精补髓，取“阴中求阳”之义，为臣药。再用菟丝子、杜仲补肝肾，强腰膝，配以当归养血和血，共补肝肾精血，为佐药。诸药合用，以温肾阳为主而阴阳兼顾，肝脾肾并补，妙在阴中求阳，使元阳得以归原。相关研究发现，补肾活血中药可显著减轻KOA大鼠膝关节肿胀，改善软骨形态，延缓软骨退变，提示补肾活血中药治疗 KOA 可能具有缓解症状和修复结构的效果[6]。

本课题组前期研究发现，右归丸能消除 KOA 模型大鼠膝关节肿胀，可有效延缓KOA模型大鼠的关节软骨退变，其作用机制可能与降低血清 IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子水平，降低Wnt信号通路的WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5蛋白表达，以及升高DKK1的蛋白表达有关[7-8]。本研究通过观察右归丸对KOA模型组大鼠软骨病理的影响，结果发现低、中、高剂量右归丸均能减轻KAO模型组大鼠软骨结构破坏的范围和严重程度，改善软骨细胞的形态结构并具有延缓关节软骨退变的作用。Mankin评分进一步说明低、中、高剂量右归丸可减轻KOA模型组大鼠的软骨损伤，证实了右归丸延缓软骨退变、保护软骨的作用，并呈现剂量依赖性，尤以右归丸高剂量组作用最为明显，其可能机制是右归丸通过其方中的附子、肉桂、鹿角胶、熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、菟丝子、杜仲等药达到滋阴益肾、养肝补脾、填精补髓等功效，从而恢复肝肾对膝关节的濡养作用，有效改善KOA模型大鼠关节软骨形态，达到延缓关节软骨退变的目的。

Hsp90可以加重KOA机体的关节软骨退化，在促进其机体关节软骨细胞释放NO中可能发挥重要的作用[9-10]。Hsp90是热休克蛋白家族的成员之一，主要有Hsp90α和Hsp90β 两种亚型，其功能的发挥可能是通过PI3K/Akt、IKK和NF-κB等信号通路完成的[11-12]。在骨关节炎中，软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和降解之间的动态平衡被打破，其中以降解占主导地位。Fn属于ECM的非胶原糖蛋白成分。胶原蛋白和弹性蛋白等结构蛋白可以通过纤连蛋白、层粘连蛋白以及其它的连接分子直接或间接与细胞表面受体结合而发挥调节细胞存活、分化、形态、迁移、组织稳态的建立与维持等生理功能[13]。Tao 等[14]研究发现，Fn可以与整合素α5β1受体相互作用增强软骨修复。还有研究发现，COL-Ⅱ合成减少和降解加速与KOA的发生发展呈正相关，IL-1β 可抑制COL-Ⅱ蛋白的合成，使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和合成前列腺素，同时MMP-1和MMP-13的分泌可以裂解ECM中的COL-Ⅱ蛋白，破坏其形成的网架结构，促进软骨基质的降解，导致软骨发生破坏和缺损[15-19]。本实验结果也发现，低、中、高剂量右归丸均能减少模型组大鼠炎症因子IL-1β及基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-13的分泌，同时降低了模型组大鼠Hsp90α表达，增强了模型组大鼠COL-Ⅱ和Fn的蛋白表达。这一结果说明右归丸可能通过其方药中的当归、附子和肉桂等来达到活血化瘀、通络止痛的功效，进一步抑制KOA模型大鼠炎症因子、基质金属蛋白酶和Hsp90α的表达，增强其COL-Ⅱ和Fn的蛋白表达，从而使软骨基质的合成与降解处于动态平衡，减少软骨细胞凋亡，延缓关节软骨退变，发挥对关节软骨的保护作用，并呈现剂量依赖性，尤以右归丸高剂量组作用最为明显。

综上所述，右归丸可能是通过“补益肝肾、活血化瘀、通络止痛”等作用抑制KOA模型鼠炎症因子和基质金属蛋白酶的分泌并调控软骨组织Hsp90α、COL-Ⅱ和Fn的蛋白表达来达到抑制软骨细胞外基质降解、延缓关节软骨退化、促进关节软骨重构的目的，从而发挥治疗作用。