吴江立,安胜军,常 宏, 2△
(1 河北中医学院科技处, 河北 石家庄 050091; 2苏州卫生职业技术学院医学技术学院, 江苏 苏州 215009)
高脂血症是指血清中一种或几种脂质指标浓度水平高于正常值,是一种全身性疾病。其可进一步导致动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS),继而引发冠心病、脑卒中和心肌梗死等病症,严重危害人类健康。他汀类药物在临床上广泛用于高血脂的治疗,但是仍有患者在最大承受剂量的情况下血脂不能恢复到正常水平。
低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)在脂类代谢的环节中起着重要的作用,可介导肝脏对脂蛋白的代谢和摄取,维持低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)在一个稳定的水平。人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)属于前蛋白转化酶家族中一员,又称神经细胞凋亡调节转化酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1,NARC1)蛋白,可与血液中LDLR的表皮生长因子A(epidermal growth factor A,EGF-A)结构域结合,加速LDLR降解[1],从而导致血液中LDL-C水平升高[2],故PCSK9-LDLR信号通路在调节血脂方面受到越来越多的关注[3-4]。
三七又名人参三七,为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen的干燥根,其性温,微苦,三七总皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)为其主要活性成分,具有活血化瘀的功效。有研究报道,PNS能显著降低大鼠血清总胆固醇(total cholesterol,TC)和LDL-C的含量,降低血清羟自由基(-OH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的浓度等[5-7]。以其作为有效成份的药物(血塞通注射液和三七胶囊)在临床也被广泛用于心脑血管疾病的治疗[8-9]。有关PNS的降脂研究大多集中在血液生理生化指标的测定方面,未涉及具体的降脂机制。PNS在降脂过程中对PCSK9和LDLR表达水平影响如何,未见报道。鉴于以上问题,本课题研究了PNS对高脂血症金黄地鼠血脂水平的调节作用,并探讨其是否可以通过影响PCSK9-LDLR通路来调节血脂代谢。
SPF级叙利亚雄性金黄地鼠30只,6~8周,体质量(120±10) g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。高脂饲料配方[10]由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,生产许可证:SCXK(京)2014-0008。
血塞通注射液(云南白药集团股份有限公司),购于石家庄市康和药房。
TC、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、LDL-C、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)试剂盒购自石家庄志诚医疗器械有限公司;RNA提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司;引物为Invitrogen设计;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;高效RIPA组织/细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司;抗LDLR抗体(ab30532)购自Abcam;抗PCSK9抗体(A7860)和抗GAPDH抗体(AC033)购自ABclonal;Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Rabbit/Mouse IgG(H+L)购自上海斯信生物科技有限公司;ECL发光试剂盒购自武汉塞维尔生物技术有限公司。
4.1动物分组及给药 30只叙利亚金黄地鼠给予普通饲料适应性喂养1周后,随机分为2组,即正常对照(normal,N)组10只和高脂模型组20只。其中,正常对照组饲喂普通饲料,自由饮水;高脂模型组饲喂高脂饲料,自由饮水。造模4周后,眼内眦取血检测TC和TG的含量,当模型组地鼠血清TC和TG水平与正常组相比显著升高时,表示造模成功。将造模成功的动物随机分为模型(model,M)组(10只)和PNS给药(S)组(10只),其中, PNS组地鼠每天腹腔注射血塞通注射液(50 mg/kg),给药剂量约为成人用药的30倍[11];正常对照组和高脂模型组地鼠每天腹腔注射等量的生理盐水。每周测量体重1次以调整给药量,给药周期12周。
4.2标本采集 末次给药后,以10%的水合氯醛麻醉地鼠,眼内眦取血,随后打开胸腔,分离肝脏,部分置于4%多聚甲醛固定,余下部分置于-80 ℃冰箱保存备用。
4.3血脂和肝功的检测 将血液室温静止2 h,4 ℃、3 000×g离心15 min,分离血清,采用全自动生化分析仪测定TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和AST。
4.4Real-time PCR检测mRNA的表达 取地鼠肝脏组织,采用RNA快速提取试剂盒提取RNA,用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度,之后用Reverse Transcriptase Kit合成cDNA,以其为模板,采用SYBR qPCR Mix试剂盒进行荧光定量PCR。LDLR 上游引物序列为5’-GGACCTCAAGATTGGCTACGAG-3’,下游引物序列为5’-TCGTGGCGATTAGTGAAGAGC-3’;PCSK9上游引物序列为5’-CCTGCCTTTGTGGTGAAGATGA-3’,下游引物序列为5’-TGACCCTGCCCTCAATTTCC-3’;β-actin上游引物序列为5’-AAAGAGCACTTCCGGTGTCCAG-3’,下游引物序列为5’-CTGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR条件为:95℃预变性10 min;95℃变性15 s,60℃退火30 s,60℃延伸30 s,循环40次,之后进行熔解曲线分析。以β-actin作为内参照,按照2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。
4.5免疫组织化学染色检测PCSK9和LDLR在肝脏的表达 将固定在4%多聚甲醛的肝脏组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋,随后进行连续切片厚度5 μm,切片于68 ℃下烘烤1 h,经二甲苯脱蜡,梯度乙醇复水,于37 ℃,过氧化氢孵育10 min以去除内源性过氧化物酶的影响,随后用柠檬酸缓冲液高压抗原修复3 min,之后加入Ⅰ抗(LDLR,1∶400;PCSK9,1∶400),4 ℃孵育过夜,PBS清洗3次之后滴加Ⅱ抗,之后进行DAB显色、苏木素复染,中性树胶封片,Leica显微镜下观察拍照。
4.6Western blot 检测LDLR和PCSK9的表达 提取肝脏组织总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,之后将蛋白进行12% SDS-PAGE,随后将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉于37 ℃封闭1 h,加入Ⅰ抗(兔抗LDLR抗体1∶500;兔抗PCSK9抗体1∶500; 鼠抗GAPDH抗体1∶10 000), 4 ℃过夜,后用TBST洗膜3次,加入Ⅱ抗(HRP标记的羊抗兔/鼠IgG,1∶5 000),37 ℃孵育1 h,TBST充分洗膜后,用ECL试剂显色,在凝胶成像系统 Fusion Fx5 Spectra 进行曝光和拍照,用ImageJ软件进行灰度分析。
所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示,多组比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
与正常对照组相比,高脂模型组地鼠血清TC、TG和LDL-C水平均显著升高(P<0.05),而经过PNS治疗后,与模型组相比,TC、TG和LDL-C水平均显著降低(P<0.05);HDL-C水平在3组之间无显著变化(P>0.05),见图1。
Figure 1. The levels of blood lipids in different groups of the hamsters. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
图1 各组地鼠血清的血脂水平
与正常对照组比较,模型组血清ALT活性显著升高(P<0.05),AST虽有升高但变化不明显(P>0.05);与模型组比较,PNS组血清ALT活性显著降低(P<0.05),AST无显著变化(P>0.05),见图2。
Figure 2. The ALT and AST activity in serum in different groups of the hamsters. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
图2 各组地鼠血清ALT和AST的活性
Real-time PCR结果显示,与正常对照组相比,高脂模型组地鼠肝脏中PCSK9 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),LDLR mRNA表达水平显著降低(P<0.05);与高脂模型组相比,PNS组地鼠肝脏中PCSK9mRNA表达水平虽有降低,但无显著差异(P>0.05),LDLR mRNA表达水平降低,差异不显著(P>0.05),见图3。
Figure 3. Relative mRNA expression levels of hamster hepatic PCSK9 and LDLR in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsN group.
图3 肝脏中PCSK9和LDLR mRNA表达水平
免疫组化显示,PCSK9主要分布在肝细胞的细胞膜上,LDLR蛋白在细胞膜和细胞质均有分布,见图4。Western blot结果表明,与正常对照组相比,高脂模型组肝脏PCSK9的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),LDLR蛋白表达水平显著下降(P<0.05);与高脂模型组相比,PNS组PCSK9蛋白表达水平显著降低(P<0.05),LDLR蛋白表达水平显著升高(P<0.05),见图5、6。
Figure 4. The distribution of PCSK9 and LDLR in the liver. Scale bar=50 μm.
图4 PCSK9和LDLR在肝脏中的分布
Figure 5. The protein expression of PCSK9 in the hamster liver of different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
图5 各组地鼠肝脏PCSK9蛋白的表达
Figure 6. The protein expression of LDLR in the hamster liver of different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
图6 各组地鼠肝脏LDLR蛋白的表达
随着人们生活水平的提高,高脂血症的发病率逐年上升,严重危害人类健康。对高脂血症动物模型进行研究,有助于模拟人类此疾病的发展和治疗。大鼠作为经典高血症动物模型,由于其血浆中LDL-C和HDL-C比例与人类存在较大不同,其使用比例在国外逐渐减少[12]。小鼠体内HDL-C是主要的载脂蛋白,也与人类不同[13]。本研究选择金黄地鼠作为建模的动物,因其胆固醇的合成和代谢与人类相似[14],不足之处是地鼠尾巴短小,采血困难。本研究模型组地鼠血清中TC、TG和LDL-C含量与正常对照组相比明显升高,说明造模成功。经PNS治疗后,地鼠血清中TC、TG和LDL-C水平与模型组相比显著下降,说明PNS确实可以降低血脂,与前期研究结果相符[5-6]。
长期的高脂饮食可导致肝脏损伤、肝细胞变性坏死。ALT是目前肝功能损害最敏感的检测指标[15]。本研究中,模型组金黄地鼠血清中ALT活性与正常对照组相比显著升高,提示高血脂地鼠的肝功能受到损害;经过PNS治疗后,血清ALT活性明显下降,说明PNS减轻了肝脏的脂肪病变,有保护肝脏的功能,与之前在大鼠中的报道相同[6]。AST在本实验中并未发生显著变化,其具体原因还需进一步深入研究。
目前对于高血脂的治疗,他汀类药物是首选药物,但是研究发现,他汀类药物可以使血液中的PCSK9升高。PCSK9基因为家族性高胆固醇血症的易感基因之一[16],对胆固醇的水平有很大的影响[17], PCSK9通过降解LDLR而使血液LDL-C水平升高。鉴于此,PCSK9已成为降血脂的一个新的治疗靶点。有报道显示PCSK9抑制剂能明显降低高血脂小鼠血清的TC、TG和LDL-C水平[18],有望成为降血脂的新药。本研究中,PNS可使高血脂地鼠肝脏中PCSK9蛋白的表达水平显著下降,LDLR蛋白表达水平显著上升,表明PNS可能通过降低PCSK9蛋白表达,减少LDLR的降解,增加LDLR的含量,促进肝脏对LDL-C的摄取,从而使血脂维持在一个正常的水平。PNS可使肝脏PCSK9 mRNA表达有所降低,但是与模型组相比无显著差异,这意味着三七总皂苷并没有在转录水平影响PCSK9的表达,而是从蛋白稳定性方面来影响了PCSK9的蛋白水平。本研究只是做了初步的探讨,如想进一步确定PCSK9是三七总皂苷降低LDL-C的分子靶点,仍需进一步深入研究。
综上所述,本研究显示三七总皂苷可以降低高脂血症金黄地鼠肝脏中PCSK9蛋白的表达,升高LDLR蛋白的表达,通过PCSK9-LDLR信号通路减轻脂代谢紊乱,从而降低高脂模型金黄地鼠血清脂类的含量(示意图见图7)。
Figure 7. The schematic diagram of panax notoginseng saponins regulating blood lipid level through PCSK9-LDLR pathway
图7 三七总皂苷通过PCSK9-LDLR通路调节血脂水平示意图