米非司酮对耐奥拉帕尼卵巢上皮癌细胞生长与干性的抑制作用*

陈 丽，李 华，闫 怡，李柱娟，石 磊，柏 义，罗文婷

(重庆市江津区中心医院妇科， 重庆 江津 402260)

卵巢癌是女性死亡的重要原因。尽管在分子生物学、影像诊断学和多学科治疗方面已经取得了巨大进展，但卵巢癌预后仍然很差[1]。多数卵巢癌患者在诊断时已是晚期，5年生存率小于50%[2-3]。奥拉帕尼(olaparib)是一种全新的口服多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制剂，用于治疗乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene,BRCA)突变相关的晚期卵巢癌[4]。但一些患者在使用奥拉帕尼后出现耐药，从而导致治疗失败，奥拉帕尼耐药的出现促使研究者寻找能够挽救性治疗耐奥拉帕尼卵巢癌的药物[5]。米非司酮(mifepristone，MIFE)为孕激素及其受体拮抗剂，临床上主要用于避孕、终止早孕和激素替代治疗。有研究发现米非司酮可以抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞凋亡，并可以在一定程度上杀伤卵巢癌耐药细胞[6-7]。本研究旨在探索米非司酮对奥拉帕尼耐药的卵巢上皮癌(ovarian epithelial cancer,OEC)细胞生长和干性的影响。

材 料 和 方 法

1 标本来源

取本院妇科手术切除新鲜标本5例。术后肿瘤组织病理检查证实均为卵巢上皮癌。患者年龄34～61岁，平均43.6岁。临床分期：3例Ⅱ期，2例Ⅲ期。所有纳入患者术前均未进行过放化疗等治疗。患者书面同意本研究，并且本研究通过本院伦理委员会批准。

2 实验试剂

胶原酶A、MCDB/M199培养基和胎牛血清购自Gibco；奥拉帕尼由北京科莱博公司合成；米非司酮购自Sigma；MTT试剂购自于江苏碧云天公司；抗Ki-67抗体购自Santa Cruz；FITC标记的II抗购自Molecular Probes；RNA提取TRIzol试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTMII试剂盒购自TaKaRa；PE标记的CD24和FITC标记的抗CD44抗体购自BioLegend。

3 实验方法

3.1原代细胞分离与培养 将新鲜获取的5例OEC组织在细胞间超净工作台清洗后，用剪去掉周围坏死组织、血凝块及脂肪组织等，分别移入无菌培养皿中，眼科剪剪碎至1 mm×1 mm×1 mm，每例样本组织分成3等份至15 mL离心管中，各加入0.2 g/L胶原酶A溶液10 mL吹打均匀，转移至37 ℃恒温摇床消化4 h，常温3 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀部分用无菌PBS重悬，重复离心3次后，分别用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/链霉素的MCDB/M199培养基重悬，分别转移至直径3.5 cm培养皿中，并添加霍乱毒素(100 μg/L)、氢化可的松(15 mg/L)、胰岛素(440 mg/L)及肝素(4 mg/L)等细胞生长因子，细胞孵箱(5% CO2，37 ℃)内培养5 d后换液，多数卵巢癌细胞及少量成纤维细胞贴壁，之后根据细胞培养基颜色及细胞生长情况每隔2～3 d换液，待细胞80%左右融合时，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。因成纤维细胞相比卵巢肿瘤细胞易脱落，采用差速消化法，在倒置显微镜下观察，待成纤维细胞基本消化完成时，吸去上层液体，重新加入胰蛋白酶进行消化后再培养。如此方法反复培养2次，将最终将消化后细胞稀释至2×108/L，继续分别传代培养[8]。每例样本组织获得的OEC原代细胞分别标记为OEC-Ⅰ、OEC-Ⅱ、OEC-Ⅲ、OEC-Ⅳ和OEC-Ⅴ。分别取4～8代细胞用于后续实验。

3.2耐药细胞构建 根据文献[9]报道的方法，每例样本组织获得的OEC细胞分别在连续递增浓度的奥拉帕尼构建配对匹配的耐奥拉帕尼OEC细胞(OEC/olaparib细胞)。从2 μmol/L奥拉帕尼为初始药物浓度，并采用浓度递增反复刺激的方法，最终逐渐增加至最终浓度12 μmol/L，以模拟每日口服400 mg奥拉帕尼的卵巢癌患者的典型稳态血浆浓度[10]，最终使得细胞能耐受12 μmol/L奥拉帕尼。最终构建的对应原5例样本组织获得的OEC细胞的5组OEC/olaparib细胞，分别标记为OEC-Ⅰ/olaparib、OEC-Ⅱ/olaparib、OEC-Ⅲ/olaparib、OEC-Ⅳ/olaparib和OEC-Ⅴ/olaparib。每组耐药细胞于实验前在含有6 μmol/L奥拉帕尼的培养基中培养1周。

3.3MTT实验验证OEC/olaparib细胞构建的效果 按照文献[11]界定药物浓度范围为0～200%(血浆药物浓度峰值)，按照文献[10]计算出奥拉帕尼的浓度范围为0～40 μmol/L。5例组织样本来源的OEC细胞和与之配对匹配的OEC/olaparib细胞接种于96孔板(每孔5 000个)中，并分别用(0、10、20、30和40 μmol/L)奥拉帕尼在5% CO2、37 ℃下处理OEC/olaparib细胞48 h，去除培养基，每孔加入100 μL MTT溶液，继续培养3 h。将所得的甲臜晶体溶解在DMSO中，在570 nm下进行定量分光光度测定细胞活力，并使用GraphPad Prism 6软件制作细胞生存曲线。

3.4MTT实验检测体外米非司酮对OEC/olaparib细胞活力的影响 为评价米非司酮的剂量反应效应，分别取构建的5组OEC/olaparib细胞用不同剂量[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]的米非司酮处理48 h。然后采用MTT法检测细胞的活力。

3.5集落形成实验 取构建的OEC-Ⅱ/olaparib细胞接种在6孔板中(每孔1 000个细胞)，用不同剂量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮处理48 h，然后更换不含米非司酮的培养基。培养10 d后，用4%PFA固定细胞，然后用0.1%结晶紫染色。计算可见集落的数量。

3.6流式细胞术 取构建的OEC-Ⅱ/olaparib细胞接种在6孔板中，用不同剂量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮处理48 h后，收集OEC/olaparib细胞，并用抗CD24(PE标记)，抗CD44(FITC标记)或相应的同型对照抗体在4 ℃孵育30 min，然后使用流式细胞术分析。

3.7RNA提取与RT-qPCR 取构建的OEC-Ⅱ/olaparib细胞接种在6孔板中，用不同剂量的[溶媒(0.01%乙醇)、0.1、1和10 μmol/L]米非司酮处理48 h后，收集OEC/olaparib细胞，利用TRIzol法从细胞中提取总RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录为cDNA。利用SYBR® Premix Ex TaqTMII Kit进行实时定量PCR实验。CD24正向引物序列为5’-TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3’，反向引物序列为5’-GAAAACTGAA TCTCCATTCCACAA-3’；CD44的正向引物序列为5’-ACCTCTCATTACCCAC ACACG-3’，反向引物序列为5’-TGACTTTTTCTTCTGCCCACA-3’； CD133的正向引物序列为5’-TGGGGCTGCTGTTTATTATTAT-3’，反向引物序列为5’-AACCATAGAAGATGCCAATGCT-3’； GAPDH的正向引物序列为5’-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3’，反向引物序列为5’-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3’。以GAPDH作为内参照。结果采用2-ΔΔCt算法来计算。

3.8裸鼠成瘤实验 6周龄的雌性BALB/c裸鼠购自重庆医科大学实验动物中心[SCXK(渝) 2018-0003]，在SPF级动物房饲养1周后，进行构建卵巢癌异位移植瘤。取构建的OEC-Ⅱ/olaparib细胞将单细胞悬浮液(100 μL PBS中含有1×107个细胞)注射到裸鼠体内皮下。当肿瘤生长到100～200 mm3时，将小鼠随机分为对照组和5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg米非司酮治疗组，每组5只。米非司酮的剂量与治疗方法结合文献[12-13]并稍作修改，治疗组裸鼠分别腹腔注射5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的米非司酮(溶剂为0.01%乙醇)，对照组注射相同体积的溶剂；每天治疗2次，持续14 d。每2 d测量肿瘤体积1次，计算公式为：体积=长度×宽度2/2。在30 d实验结束时，麻醉小鼠称重，取异位移植瘤组织称重，福尔马林固定，石蜡包埋，准备免疫组化染色。

3.9免疫组化染色 将切片在二甲苯中脱蜡，使用梯度乙醇脱水，然后在0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中用高压釜煮沸20 min。用0.3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物活性，并用正常山羊血清孵育切片，以减少非特异性结合。组织切片用抗Ki-67抗体(1 ∶500)在4 ℃下孵育过夜。免疫组化EnVision二步染色法参照试剂盒说明书进行。以PBS代替 I 抗作为阴性对照。组织抗原修复均采用高温高压修复处理，最终在光学显微镜下成像。

4 统计学处理

利用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用成组t检验，多组定量资料的比较采用单因素方差分析方法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 建立耐奥拉帕尼细胞

选择不同浓度的奥拉帕尼处理5组OEC细胞和构建的5组OEC/olaparib细胞48 h，MTT实验检测细胞活力，结果显示5组OEC/olaparib细胞对奥拉帕尼的敏感性显著低于匹配的OEC细胞(P<0.01),见图1。以上数据说明，我们成功建立了耐奥拉帕尼细胞OEC/olaparib。

Figure 1. The viability of OEC cells and OEC/olaparib cells with olapanib treatment was measured by MTT assay. A: OEC-Ⅰ and OEC-Ⅰ/olaparib cells; B: OEC-Ⅱ and OEC-Ⅱ/olaparib cells; C: OEC-Ⅲ and OEC-Ⅲ/olaparib cells; D: OEC-Ⅳ and OEC-Ⅳ/olaparib cells; E: OEC-Ⅴ and OEC-Ⅴ/olaparib cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsOEC/olaparib cells.
图1 MTT法检测OEC细胞和OEC/olaparib细胞在奥拉帕尼处理下细胞活力的变化

2 米非司酮抑制OEC/olaparib细胞的活力

采用不同浓度的米非司酮处理5组OEC/olaparib细胞48 h，MTT实验检测细胞活力，结果显示，米非司酮能浓度依赖性抑制OEC/olaparib细胞活力(P<0.05或P<0.01)，见图2。

Figure 2. Mifepristone (MIFE) inhibited the viability of OEC/olaparib cellsinvitroin a dose-dependent manner. A: OEC-Ⅰ and OEC-Ⅰ/olaparib cells; B: OEC-Ⅱ and OEC-Ⅱ/olaparib cells; C: OEC-Ⅲ and OEC-Ⅲ/olaparib cells; D: OEC-Ⅳ and OEC-Ⅳ/olaparib cells; E: OEC-Ⅴ and OEC-Ⅴ/olaparib cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
图2 米非司酮呈剂量依赖性抑制OEC/olaparib细胞的活力

3 米非司酮抑制OEC/olaparib细胞集落数

集落形成实验的结果显示，与溶媒对照组相比，用米非司酮处理的OEC/olaparib细胞形成的集落数显著减少(P<0.05或P<0.01)，且米非司酮对OEC/olaparib细胞集落形成的抑制作用呈剂量依赖性，其中10 μmol/L米非司酮组的抑制作用最显著(P<0.01)，见图3A。由亮视野显微镜图像可见，经10 μmol/L米非司酮处理的OEC/olaparib细胞显示出较差的生存能力,见图3B。

Figure 3. Mifepristone (MIFE) inhibited the growth of OEC/olaparib cellsinvitroin a dose-dependent manner. A: the representative images of cell colony after treatment with different doses of mifepristone and the quantitative analysis of the number of colonies; B: bright field microscopic images (the scale bar=1 mm) taken by inverted microscope after treatment with different doses of mifepristone. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
图3 米非司酮呈剂量依赖性抑制OEC/olaparib细胞生长

4 米非司酮抑制卵巢癌耐药细胞的干性

通过测量OEC/olaparib细胞中3种肿瘤干细胞标志物CD24、CD44和CD133的表达来评估OEC/olaparib细胞的干性。RT-qPCR结果显示，与溶媒对照组相比，米非司酮治疗组这3个标志物的表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，经10 μmol/L米非司酮处理的治疗组干细胞标志物的下调最为显著(P<0.01)，见图4A，说明米非司酮对干细胞标志物的下调效应呈剂量依赖性。通过流式细胞术检测OEC/olaparib细胞中CD24和CD44的蛋白表达，结果显示 10 μmol/L米非司酮处理显著降低了CD24+、CD44+和CD24+/CD44+细胞亚群的数量(P<0.01)，见图4B～D。以上结果说明，米非司酮对卵巢癌耐药细胞的干性有抑制作用。

Figure 4. Mifepristone (MIFE) reduced the stemness of OEC/olaparib cells. A: relative mRNA levels of cancer stem cell markers CD24, CD44 and CD133 in the OEC/olaparib cells after MIFE treatment; B: MIFE reduced CD24 protein expression of in the OEC/olaparib cells; C: MIFE reduced the protein expression of CD44 in the OEC/olaparib cells; D: MIFE reduced the population of CD24+/CD44+OEC/olaparib cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group.
图4 米非司酮抑制卵巢癌耐药细胞的干性

5 米非司酮抑制OEC/olaparib细胞在体内的生长

裸鼠异位移植瘤实验的结果显示，在实验结束时，各组小鼠体重的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图5A；而米非司酮治疗组裸鼠肿瘤的大小、重量和体积明显小于溶媒对照组(P<0.01或P<0.01)，经20 mg/kg米非司酮处理组的肿瘤大小、重量和体积降低最为显著(P<0.01)，见图5B、C。对肿瘤组织进行免疫组化染色以检测Ki-67的表达，统计结果显示，与溶媒对照组相比，20 mg/kg米非司酮治疗组的肿瘤组织中Ki-67蛋白的表达较低(P<0.01)，见图5D。以上数据说明，米非司酮呈剂量依赖性地降低了OEC/olaparib细胞在体内的生长能力。

Figure 5. Mifepristone (MIFE) inhibited OEC/olaparib cell growth in nude mice xenografts. A: at the end of the experiment, the body weight of each group of the mice was calculated; B: photographs and weight of xenograft tumors in each group; C: statistical results of the tumor volume in each group during 30 d; D: representative images and statistical results of Ki-67 staining of xenograft tumors in 20 mg/kg MIFE treatment group and vehicle group. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsvehicle group.
图5 米非司酮抑制裸鼠移植瘤OEC/olaparib细胞生长的观察

讨 论

卵巢癌是常见的妇科肿瘤，据统计，在我国卵巢癌发病率居妇科肿瘤第4位，死亡率居第3位[14]。复发和耐药是卵巢癌晚期患者预后不良的主要原因。晚期卵巢癌治疗策略的改进是亟待解决的问题。

奥拉帕尼(商品名TynparzaTM，原名AZD2281)是一种全新的口服PARP强抑制剂，于2014年被FDA和EMA批准为一类用于治疗BRCA基因突变相关的晚期卵巢癌的PARP抑制剂[15]。而一些卵巢癌患者经一段时间奥拉帕尼治疗后，会出现耐药。针对PARP抑制剂耐药性原因的研究表明，在大多数情况下，这种耐药性的机制是未知的，另外约有15%的BRCA突变逆转以及10%的TP53BP1基因突变所致[16]。

米非司酮是一种作用于受体水平的孕激素拮抗剂，兼有抗糖皮质激素的作用，临床上主要用于终止早孕、紧急避孕和引产等。利用其抗孕激素活性治疗子宫肌瘤、子宫内膜异位症和异位妊娠等也获得成功。研究发现，米非司酮可抑制卵巢癌上皮细胞的生长，对于化疗耐药性卵巢癌也具有一定的疗效[13, 17-18]。而米非司酮对奥拉帕尼耐药的卵巢癌作用如何尚不清楚。本研究采用胶原酶A酶解组织块法进行上皮性卵巢肿瘤细胞原代培养，并添加不同细胞生长促进因子，可获得活性较高、数量较多的原代细胞[19]。进行体外原代细胞培养是研究上皮性卵巢肿瘤发生发展机制及对药物反应的重要途径[20]。相比细胞系，原代培养细胞更加接近人体内肿瘤细胞特性，更适宜用于实验研究及指导临床治疗。本研究采用卵巢上皮癌原代细胞，成功建立了奥拉帕尼耐药的衍生细胞系，探讨米非司酮对奥拉帕尼耐药的卵巢上皮癌细胞的作用。结果显示米非司酮在体内外可以抑制奥拉帕尼耐药细胞的生长，并且这种作用呈剂量依赖性，其抑制作用可能与下调耐药细胞的干性相关。另外，多项研究报道了奥拉帕尼与顺铂、卡铂和环磷酰胺等DNA损伤剂的协同作用[21-22]。因此，奥拉帕尼与其他化疗药物的联合治疗肿瘤可能是一个有希望的治疗手段，是否可以通过奥拉帕尼和米非司酮联合用药，延长晚期卵巢癌患者的总生存，也是未来值得研究的方向。

综上所述，本研究发现米非司酮可以在体内外抑制奥拉帕尼耐药卵巢上皮癌细胞的生长和干性。本研究对米非司酮用于奥拉帕尼耐药卵巢癌的治疗提供了一个理论参考依据。