段 斌,符 浩,王昕禧
(南华大学附属南华医院泌尿外科, 湖南 衡阳 421002)
膀胱癌是常见实体恶性肿瘤,其早期的发病较为隐匿,且常常以隐匿性转移为特点,因此研究膀胱癌转移分子机制对于膀胱癌的治疗具有重要意义[1-3]。肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一种近年来发现的长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA),其在结直肠癌和肺癌等肿瘤中高表达,具有调控肿瘤细胞上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)、侵袭和迁移等作用[4-5]。目前在膀胱癌中发现MALAT1高表达与膀胱癌患者淋巴转移等有关[6],但对于MALAT1影响膀胱癌细胞侵袭迁移的机制尚不明确。有研究表明,MALAT1可以下调肝细胞癌细胞中微小RNA(microRNA, miR)-146b-5p的表达从而促进肿瘤的发展[7]。基于此,本实验以膀胱癌BIU-87细胞作为体外研究对象,探讨MALAT1和miR-146b-5p对膀胱癌细胞侵袭、迁移能力的影响和机制。
膀胱癌BIU-87细胞购自广东省医学实验动物中心肿瘤细胞库。MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-146b-5p mimics、mimics control、miR-146b-5p inhibitor和inhibitor control由上海吉玛生物制药有限公司构建合成;cDNA合成试剂盒购自Thermo Fisher Scientific;定量PCR试剂购自TaKaRa;抗基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase,MMP-2)抗体购自Cell Signaling Technology;抗波形蛋白(vimentin)抗体和抗上皮型钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadhe-rin)抗体购自Abcam;突变型和野生型萤光素酶报告载体由广州辉骏生物科技有限公司构建;Lipofectamine 2000转染试剂和TRIzol试剂购自Invitrogen;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, MALAT1的上游引物序列为5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3’, 下游引物序列为5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGC-3’; miR-146b-5p的上游引物序列为5’-CCTGGCACTGAGAACTGAAT-3’, 下游引物序列为5’-GCACCAGAACTGAGTCCACA-3’; GAPDH的上游引物序列为5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3’,下游引物序列为5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’; U6的上游引物序列为5’-AGAGAGATTACATGGCCCCT-3’,下游引物序列为5’-CTAATGTCACGCACGATTCT-3’。
2.1细胞转染和敲减效果检测 用Lipofectamine 2000将MALAT1 siRNA和siRNA control转染至BIU-87细胞中,步骤同转染试剂说明书。把转染MALAT1 siRNA和siRNA control后的细胞设置为si-MALAT1组和si-con组,未转染的细胞记为对照(control)组。Control、si-con和si-MALAT1组细胞在转染48 h后,以real-time PCR检测敲减效果。
用TRIzol方法提取细胞总RNA,RNA保存在-80 ℃。取2 μg的RNA,用Oligo dT反转录合成cDNA,步骤同cDNA合成试剂盒。合成cDNA保存在-20 ℃用于后续实验。荧光定量PCR体系为0.4 μL的SYBR Green qPCR Super Mix-UDG、1 μL的cDNA、8.4 μL的DEPC水和0.4 μL的引物。PCR程序为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s,共40个循环。根据反应的Ct值计算MALAT1的表达水平,方法为常规2-ΔΔCt法,内参照设置为GAPDH。
2.2Transwell法检测下调MALAT1后膀胱癌BIU-87细胞侵袭和迁移能力的变化 用不含血清的细胞培养液将control、si-con和si-MALAT1组细胞配制成浓度为1×109/L的单细胞悬浮液,将100 μL的细胞悬浮液添加到Transwell小室的上室中,在下室中添加含有10%胎牛血清的细胞培养液,放在37 ℃孵育48 h以后,用棉签将没有穿膜的细胞擦掉,用结晶紫染色后,在显微镜下随机选取5个视野分析细胞迁移数目。侵袭实验步骤同上,在侵袭实验前用基质胶将小室湿化。
2.3Western blot检测下调MALAT1后膀胱癌BIU-87细胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白的表达水平 在转染48 h后的control、si-con和si-MALAT1组细胞中添加蛋白裂解液,放在冰上充分裂解提取细胞中的总蛋白。制备SDS-PAGE蛋白凝胶,本次实验以10%的分离胶和5%的浓缩胶进行电泳。在蛋白样品中添加5×上样缓冲液,放在100 ℃孵育5 min。每个孔中添加30 μg的蛋白样品,marker上样量为5 μL。浓缩胶中电泳电压为80 V,分离胶中电泳电压为120 V,观察染料进入到胶板的底部以后,关闭电源,将凝胶取出。把裁剪好的NC膜放在甲醇中浸泡5 min,以100 V电压在冰水混合物上转膜,转膜时间为80 min。把NC膜放在封闭液(含有5%脱脂奶粉的TBST)中,在室温条件下孵育1 h。用封闭液配制 I 抗反应液(抗vimentin、E-cadherin抗体以1∶600稀释,抗MMP-2抗体以1∶400稀释),把NC膜置于其中,在4 ℃孵育过夜。用封闭液配制1∶4 000稀释的 II 抗反应液,NC膜置于其中在室温条件下结合1 h。用ECL法化学发光,用Quantity One分析扫描灰度值,GAPDH设置为内参照,分析蛋白表达水平。
2.4靶向预测和双萤光素酶报告系统的鉴定 利用生物信息学软件Starbase 2.0分析得知MALAT1和miR-146b-5p有互补结合位点。将MALAT1结合序列突变,构建突变型萤光素酶报告载体(pmiRGLO-MALAT1-MUT),同时构建没有突变的萤光素酶报告载体(pmiRGLO-MALAT1-WT)。将MALAT1-MUT和MALAT1-WT与miR-146b-5p mimics和mimics control共转染至BIU-87细胞中,培养48 h后,用萤光素酶活性检测试剂盒检测萤光素酶活性。设置转染miR-146b-5p mimics和mimics control后的BIU-87细胞为miR-146b-5p组和miR-NC组。参照上述real-time PCR方法测定miR-146b-5p组和miR-NC组细胞miR-146b-5p的表达变化(内参照为U6)。同时用real-time PCR检测control、si-con、si-MALAT1、vector(转染阴性对照载体pcDNA3.1)和MALAT1(转染pcDNA3.1-MALAT1)细胞中miR-146b-5p表达的变化(内参照为U6)。
2.5miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA共转染对膀胱癌BIU-87细胞侵袭、迁移能力和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表达的影响 在BIU-87细胞中共转染miR-146b-5p inhibitor和MALAT1 siRNA及inhibitor control和MALAT1 siRNA,分别命名为Si-MALAT1+anti-miR-146b-5p组和si-MALAT1+anti-NC组,用real-time PCR、Transwell法和Western blot分别测定细胞中miR-146b-5p水平、侵袭及迁移数目和MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表达变化。
实验数据用SPSS 21.0软件进行分析,计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,两组数据间比较用t检验,多组差异比较用单因素方差,组间比较用SNK-q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
Real-time PCR结果显示,si-MALAT1组膀胱癌BIU-87细胞中MALAT1表达水平明显低于si-con组(P<0.05),见图1。
Figure 1. The changes of MALAT1 expression in bladder cancer BIU-87 cells transfected with MALAT1 siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
图1 MALAT1 siRNA转染后膀胱癌BIU-87细胞中MALAT1表达的变化
与si-con组比较,si-MALAT1组膀胱癌BIU-87细胞的侵袭和迁移数目明显降低,同时细胞中MMP-2蛋白表达水平下降,间质细胞分子标志物vimentin蛋白水平降低,上皮细胞分子标志物E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05),见图2。下调MALAT1具有抑制膀胱癌BIU-87细胞的侵袭、迁移能力和EMT的作用。
Figure 2. The effect of down-regulation of MALAT1 on the number of invasion (A) and migration (B) of bladder cancer BIU-87 cells and the changes of MMP-2, vimentin and E-cadherin protein levels (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group.
图2 下调MALAT1后膀胱癌BIU-87细胞侵袭、迁移数目及MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白水平的变化
生物信息学软件预测MALAT1和miR-146b-5p有靶向结合位点,在细胞中转染miR-146b-5p mimics后,细胞中的miR-146b-5p表达水平升高。MALAT1-WT和miR-146b-5p mimics共转染后细胞萤光素酶活性降低。MALAT1可靶向调控miR-146b-5p表达,见图3。
Figure 3. MALAT1 targeted regulation of miR-146b-5p expression. A: bioinformatics software predicted the targeting binding sites of MALAT1 and miR-146b-5p; B: expression of miR-146b-5p after transfection; C: luciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.
图3 MALAT1靶向调控miR-146b-5p
si-MALAT1组BIU-87细胞中miR-146b-5p的表达水平明显高于si-con组(P<0.05)。MALAT1组BIU-87细胞中miR-146b-5p的表达水平明显低于vector组(P<0.05),见图4。MALAT1可以负向调控膀胱癌BIU-87细胞中miR-146b-5p的表达水平。
Figure 4. The effects of MALAT1 on miR-146b-5p expression in the bladder cancer BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-con group;&P<0.05vsvector group.
图4 敲减或上调MALAT1的表达对膀胱癌BIU-87细胞中miR-146b-5p表达水平的影响
si-MALAT1+anti-miR-146b-5p组膀胱癌BIU-87细胞中miR-146b-5p的表达水平明显低于si-MALAT1+anti-NC组(P<0.05),见图5。
Figure 5. Down-regulation of miR-146b-5p expression in bladder cancer BIU-87 cells after transfection with miR-146b-5p inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group..
图5 转染miR-146b-5p inhibitor后,膀胱癌细胞中miR-146b-5p的表达水平下调
与si-MALAT1+anti-NC组相比,si-MALAT1+anti-miR-146b-5p组膀胱癌BIU-87细胞的侵袭和迁移数目增加,MMP-2和vimentin蛋白水平增加,E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),见图6。下调miR-146b-5p可以逆转敲减MALAT1表达对膀胱癌BIU-87细胞侵袭、迁移能力和EMT的影响。
Figure 6. Reversal effects of miR-146b-5p inhibitor on invasion, migration abilities and the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin of bladder cancer BIU-87 cells induced by knock-down ofMALAT1expression. A: the results of Transwell assays for determining the invasion and migration abilities of bladder cancer BIU-87 cells; B: the results of Western blot for determining the effects of co-transfection of miR-146b-5p inhibitor and MALT1 siRNA on the protein expression of MMP-2, vimentin and E-cadherin in the BIU-87 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-MALAT1+anti-NC group.
图6 miR-146b-5p inhibitor逆转敲减MALAT1表达对膀胱癌BIU-87细胞侵袭、迁移能力和MMP-2、vimentin和E-cadhe-rin蛋白表达的影响
LncRNA的长度大于200 nt,不能编码蛋白质,可以通过调控不同的基因表达参与生理和病理过程[8]。MALAT1又称为NEAT2,是一个定位于染色体11q的LncRNA,MALAT1在哺乳动物体内十分保守,并且在不同组织脏器中的表达水平不同,其在肝脏和脊髓等组织中高表达,在食管组织及宫颈上皮组织中表达水平极低[9]。目前对于MALAT1的研究对象主要是肿瘤,在食管癌和宫颈癌等恶性肿瘤中发现MALAT1表达量升高,并且其表达水平越高肿瘤转移能力也越强,MALAT1在肿瘤中可能发挥类似癌基因的作用[10-12]。MALAT1具有调控肿瘤细胞转移潜能的作用,MALAT1在卵巢癌和骨肉瘤等肿瘤EMT、侵袭等过程中发挥诱导功能[13-14]。在膀胱癌的研究报道中显示,MALAT1高表达可能是肿瘤转移的标志[15]。本实验发现MALAT1 siRNA下调膀胱癌细胞中MALAT1表达后,肿瘤细胞侵袭、迁移能力降低,这与上述在其它肿瘤中的研究结果一致,均提示MALAT1可能是一种肿瘤转移促进因子。
我们的实验还发现敲减MALAT1表达后的膀胱癌细胞中的MMP-2蛋白表达水平降低,细胞中vi-mentin蛋白水平也降低,而E-cadherin蛋白水平升高,说明MALAT1具有调控膀胱癌细胞中MMP-2、vimentin和E-cadherin蛋白表达的作用。MMP-2是一种与肿瘤转移关系最为密切的基质金属蛋白酶,其可以将细胞外基质降解,为肿瘤细胞的侵袭提供条件[16]。E-cadherin是上皮细胞分子标志物,vimentin是间质细胞分子标志物,vimentin表达上调和E-cadherin表达下调是细胞EMT的标志,而肿瘤细胞EMT发生在肿瘤转移早期[17]。我们的实验说明下调MALAT1可以抑制膀胱癌细胞EMT,下调MALAT1抗肿瘤转移机制可能与其抑制肿瘤细胞EMT和合成MMP-2有关。
LncRNA发挥生物学功能与调控下游靶基因的表达有关,在很多肿瘤中已经发现LncRNA可以通过靶向调控miRNA的表达发挥促癌或抑癌作用[18]。我们的实验发现MALAT1与miR-146b-5p有互补结合位点,并且证实膀胱癌细胞中MALAT1靶向负调控miR-146b-5p的表达。miR-146b-5p是一个在多种肿瘤中表达下调的miRNA,参与肿瘤细胞生长、分化和侵袭等,miR-146b-5p能够将细胞周期阻滞在G0/G1期,并且可以抑制细胞因子TGF-β1、MCP-1和TNF-α的表达[19-20]。在肝癌的研究报道中已经表明,MALAT1能够下调miR-146b-5p表达而促进肝癌细胞侵袭和迁移[7]。本次实验还发现下调miR-146b-5p可以逆转敲减MALAT1表达对膀胱癌细胞侵袭、迁移和EMT的作用,提示敲减MALAT1表达可通过miR-146b-5p调控膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力和EMT,这与在上述肝癌细胞的研究结果相符合,说明MALAT1参与肿瘤转移机制与调控miR-146b-5p有关。
总而言之,下调MALAT1可促进miR-146b-5p表达,抑制膀胱癌细胞EMT和合成MMP-2,进而发挥抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移的作用。