皮肌炎基因表达谱的生物信息学分析

白晶晶，吴婵媛，钟丹丽，王迁，曾小峰

皮肌炎(dermatomyositis, DM)是一种以皮肤与骨骼肌受累为主要特征的系统性自身免疫性疾病。对称性的近端肌肉无力是DM常见的临床表现，患者实验室检查血清肌酸激酶水平升高，肌肉病理出现束周肌纤维萎缩与纤维化，肌束膜可见炎症细胞浸润。DM的发病机制复杂，遗传、环境、免疫机制以及非免疫调节机制等多种因素共同参与。以往研究表明，一型干扰素系统激活在DM发病中发挥重要作用，但是DM的确切致病原因及发病机制尚不清楚。

随着二代测序和基因芯片技术的不断发展及多组学数据库的建立，应用生物信息学对组学数据进行深度挖掘，预测分子间的相互作用关系，已成为研究疾病分子机制的重要方法之一。本研究利用NCBI GEO(Gene Expression Omnibus, GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库的DM基因表达谱数据筛选目的基因，并利用DAVID、KEGG以及STRING数据库分析目的基因主要富集的生物学过程、分子功能以及信号通路，为DM生物标志物的鉴定以及分子机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 表达谱数据获取与处理

数据来源于NCBI GEO数据库，数据系列号为GSE1551[1]和GSE39454[2]。样本采用Affymetrix Human Genome U133A Array平台检测。GSE1551数据集包括13例皮肌炎肌肉组织样本以及10例健康肌肉组织样本。GSE39454数据集包括8例皮肌炎肌肉组织样本以及5例健康肌肉组织样本。利用Perl软件对芯片数据进行预处理。GSE1551 数据集的GSM26526,GSM26527及GSM26530健康肌肉样本表达值分布异常,予以去除。

1.2 目的基因筛选

利用R软件的Limma包计算基因表达差异的显著性P值。以P<0.05并且|logFC|≥1为条件，筛选显著差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。利用Heml软件绘制DEGs热图。利用韦恩图将两个肌肉组织芯片数据集筛选得到的DEGs取交集，获取目的基因进行后续分析。

1.3 目的基因功能富集分析

利用富集分析工具DAVID(https://david.ncif-crf.gov/)分析目的基因参与的GO功能富集及KEGG通路功能富集。以参与富集基因个数count≥2, 矫正P<0.05为筛选条件。

1.4 目的基因蛋白质互作网络构建

结合STRING(https://string-db.org/)数据库分析目的基因的蛋白互作网络(Protein-protein interaction, PPI)。以PPI score>0.4为标准，构建目的基因的PPI网络并筛选出连接度值位于Top 10的核心(Hub)基因。构建PPI网络软件为Cytoscape (version:3.6.0)。

2 结果

2.1 差异表达基因基本信息统计

数据集GSE1551筛选出472个DEGs，其中上调311个，下调161个；GSE39454数据集共筛选出177个DEGs，其中上调153个，下调24个。2个数据集|logFC|>2的显著DEGs热图分别如图1A、1B所示。对2个数据集的DEGs取交集，共筛选出101个目的基因，其中上调基因96个，下调基因5个(表1)。

表1 GSE1551数据集和GSE39454数据集共同的差异基因Table 1 Overlapped DEGs from GSE1551 and GSE39454

2.2 目的基因功能和通路富集分析

对目的基因进行GO功能富集和KEGG-Pathway通路富集分析。GO富集主要包括抗病毒感染、抗原提呈以及趋化因子活化等，最为显著的生物学过程为一型干扰素通路的活化(图2A)；分子功能富集于抗原肽结合、双链RNA结合、TAP结合等(图2B)。KEGG-Pathway分析发现显著富集的通路包括单纯疱疹病毒、流感病毒、麻疹病毒等(图2C)。

图 1 差异表达基因热图Fig 1 Expression heatmaps of DEGsA:DM肌肉数据集GSE1551(P<0.05且|logFC|>2); B:DM肌肉数据集GSE39454(P<0.05且|logFC|>2)

2.3 目的基因PPI网络

将筛选出的目的基因映射到STRING在线分析软件，得到目的基因相互作用网络。将蛋白互作网络信息导入Cytoscape软件，分析网络的拓扑学性质(图3)。目的基因的PPI网络共有98个节点，1 008个相互作用关系，连接度值位于TOP 10的Hub基因包括STAT1、MX1、GBP1、IFIT3、ISG15、OAS2、OAS1、OAS3、RSAD2、IFIT2。

图 2 目的基因GO与KEGG功能富集分析Fig 2 GO and KEGG pathway analysis of objective genes in DM muscle samplesA:目的基因富集的主要生物学过程; B:目的基因富集的主要分子功能; C:目的基因富集的KEGG信号通路

图 3 目的基因蛋白质相互作用网络(目的基因相互作用网络由98个节点和1008个交互线组成)Fig 3 Protein-protein interaction network of the objective genes

3 讨论

DM是一种以皮肤和骨骼肌慢性炎症为主要特征的特发性炎性肌病。发病机制复杂，涉及免疫、遗传及环境等多种因素。本研究通过分析DM肌肉组织基因芯片数据集，旨在寻找潜在的诊断与治疗靶基因和靶通路，为后续的发病机制研究提供理论依据。

通过对2个DM肌肉组织芯片数据集的差异表达基因取交集，共获得101个目的基因，GO分析结果显示，目的基因所涉及的生物学过程主要包括一型干扰素通路、抗病毒反应、抗原递呈以及趋化因子活化等。KEGG通路富集分析结果显示，目的基因主要富集于多种病原体的感染，包括单纯疱疹病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒以及EB(epstein-barr)病毒等。

Magro等[3]报道了1例由于弥漫性肺泡损伤导致急性呼吸衰竭的皮肌炎患者，发现患者皮肤以及肺活检单纯疱疹病毒RNA的表达，但是病毒培养未见典型的细胞病变，推测单纯疱疹病毒感染可能是DM急性加重诱发而非机会性感染。以往研究提出病毒感染诱发皮肌炎的发生机制主要包括：病毒蛋白与宿主蛋白直接的相互作用引发自身抗原的修饰；表达隐蔽抗原决定簇的宿主蛋白的释放；抗独特型自身抗体的诱导以及宿主蛋白与病毒抗原表位的序列同源性所引发的交叉反应[4]。

Walker等[5]利用计算机序列比对的方法发现组氨酰tRNA合成酶(抗Jo-1抗体的靶抗原)的氨基酸序列与EB病毒蛋白EC-RF4部分序列相匹配，推测EB病毒蛋白所包含的抗原决定簇可能会诱发DM患者产生抗Jo-1抗体，但是该假设需要后续确切的表位鉴定以及交叉反应实验的验证。Liu等[6]发现在多种自身免疫性疾病患者的血清中可检测到抗人类巨细胞病毒抗体(抗-Pp150抗体)水平的升高,进一步研究证实该抗体可以识别NK细胞表面的CIP2A分子，并通过抗体以及补体介导的细胞毒作用诱导NK细胞凋亡。DM患者血清中的多种自身抗体可能是在特定的遗传易感的背景下病毒感染所遗留的足迹，并在DM患者的免疫系统紊乱中发挥重要作用。

根据目的基因的PPI网络，本研究共筛选出10个Hub基因，包括：STAT1、MX1、GBP1、IFIT3、ISG15、OAS2、OAS1、OAS3、RSAD2、IFIT2。Hub基因主要富集于一型干扰素通路以及抗病毒反应。

STAT1是一型干扰素通路重要的转录激活因子。一型干扰素与受体结合后，受体发生二聚体化，引发JAK1以及TYK2激活，招募STAT1与STAT2并发生磷酸化反应，活化的STAT1以及STAT2与IRF9形成复合物进入细胞核，上调大量干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISG)。其中， MX1、GBP1、IFIT3、ISG15、OAS2、OAS1、OAS3、RSAD2以及IFIT2通过抑制病毒基因组复制、激活RNase L对病毒mRNA进行降解、抑制病毒基因组翻译、抑制出芽等方式发挥抗病毒作用[7-8]。

Zhang等[9]报道抗黑色素瘤分化相关基因5抗体阳性的DM患者的皮肤组织高表达STAT1、ISG15、MX1，提示DM患者一型干扰素通路活化。Uruh等[10]研究发现DM肌肉细胞浆MX1蛋白表达水平升高，并与传统的DM病理学特征如束周萎缩以及膜攻击复合物的沉积相比，MX1具有更高的诊断效能。

IFIT3作为MAVS与TBK1之间的衔接分子，介导RIG-1抗病毒信号通路的活化[11]。研究报道IFIT3 也可以作为STING与TBK1之间的衔接分子，介导系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者单核细胞cGAS/STING信号通路的过度激活[12]，该研究发现DM患者的单核细胞在双链DNA病毒类似物VACV 70刺激后，IFN-β RNA水平没有发生显著变化，cGAS/STING信号通路未显著激活。虽然以往的研究表明DM与SLE患者都存在一型干扰素水平的升高，其上游激活的通路可能存在差异[13]。寡腺苷酸合成酶(oligoadeny-late synthetase, OAS)家族蛋白OAS1、OAS2、OAS3，通过合成2′-5′寡腺苷酸，激活RNase L，诱导病毒降解。OAS家族基因在青少年皮肌炎肌肉组织中高表达，其表达水平与固有/适应性免疫应答相关的基因存在正性相关关系[14]。

趋化因子CXCL9/10/11在皮肌炎患者肌肉组织中的RNA水平显著升高，提示CXCL9/10/11-CXCR3信号轴激活。以往的研究表明皮肌炎患者血清中CXCL10水平升高并与疾病活动度相关。Kim等[15]研究发现接受CXCL10抗体治疗的肌炎小鼠的肌肉炎症相比对照组明显缓解，提示CXCL10可能是皮肌炎治疗的潜在靶点。

本研究所挖掘的Hub基因可能为DM分子诊断提供潜在的生物标志物，并为DM发病机制研究提供依据。