呼吸道过敏患者血清中发现樟树花粉特异性IgE

田露芳，张东，苏恺，曹勇，宋洋，卢慧，龚静蓉，庞宇峰，乔中东，郭胤仕，王莲芸

变态反应性疾病(过敏性疾病)发病率逐年增加，已成为影响人类健康的重要公共卫生问题，影响人类生活质量和生活品质[1]。变应性鼻炎和哮喘是临床上最常见的呼吸道过敏性疾病，其病因可以为螨、动物皮毛、气传致敏花粉等，其中气传花粉与季节性过敏疾病密切相关[2]。有研究表明，上海市主要气传花粉来自各种树木类，其次是狗尾巴草及各种禾本科植物[3]。上海市行道树过去多为悬铃木法国梧桐，近年来增加了香樟和银杏等树种。香樟由于环境适应性强，且树形伟岸、四季常青，已经成为我国南方城市的主体行道树种。每年4～6月中旬，香樟树会开出细密的小花，花粉随风飘散[4]。本研究探讨在每年花粉季节樟树花粉是否可以作为变应原引发变态反应性疾病。

1 材料与方法

1.1 樟树花粉采集

在樟树花期4～6月采摘樟树花朵，室温下晾干，研磨后过筛，得到粗花粉。分装后置液氮中保存备用。

1.2 樟树花粉蛋白质提取液制备

纯花粉经Percoll非连续性密度梯度离心法纯化获得。将Percoll和2.5 mol/L的蔗糖按照1∶9的浓度配制成梯度分层液Ⅰ，将Percoll和2.5 mol/L的蔗糖按照3∶7的浓度配制成梯度分层液Ⅱ。然后在5 mL离心管中加入1.5 mL分层液Ⅱ，然后缓慢滴入1 mL分层液Ⅰ，使上下层分层清楚，然后加入0.5 mL花粉液(每0.2 g粗花粉与10 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液混合)，3 000 r/min离心10 min，将中间层(杂质+花粉)置于新的离心管中并与水按1∶1的比例混匀，再10 000 r/min离心3 min，弃上层，合并沉淀后，0.25 mol/L蔗糖清洗3次(3 000 r/min离心5 min)后,即可获得纯度为95%以上纯花粉。将花粉放入细胞裂解液(cell signaling)中，并加入蛋白酶抑制剂Cocktail(Roche)和苯甲基磺酰氟(PMSF)，4 ℃条件下碾磨匀浆，离心10 min后取上清，再用蛋白质浓度测定试剂盒(生工)测定蛋白浓度。

1.3 春季呼吸道过敏患者血清收集

每年的4～5月是春季花粉症的高发时期，也是樟树花盛开的季节。收集2016年4～8月在上海市仁济医院就诊的呼吸道过敏(血清总IgE明显增高)的患者血清122份。其中过敏性鼻炎65例、支气管哮喘24例、鼻炎并发哮喘33例；男性44例、女性78例；年龄在0～18岁25例，19～45岁63例，46岁以上34例。选取非过敏人血清96份作为阴性对照。将这些患者的静脉全血凝固后离心，取血清，-70 ℃保存备用。

1.4 血清中樟树花粉特异性IgE分析

花粉蛋白经PBS稀释后，4 ℃条件下包被ELISA板过夜。PBS洗涤ELISA板；每孔加入新制过氧化氢溶液100 μL孵育15 min，以去除过氧化氢酶，PBS洗板2次后。每孔加入200 μL的FACS Buffer溶液，室温下孵育1 h后，倾去液体并拍干。每孔再加入100 μL/血清，室温孵育1 h后，倾去液体，并洗板3次并拍干。用FACS Buffer溶液按照1∶1 000的比例稀释Anti-Human IgE HRP二抗，每孔加入100 μL二抗后室温孵育1 h，洗板3次，拍干板后加入100 μL/孔显色液，避光反应5～10 min后加入100 μL的2 mol/L浓硫酸终止反应，通过酶联免疫检测仪在450 nm测定吸光度，吸光度与血清中IgE的浓度成正比。

1.5 SDS-PAGE和Western blot检测

配制SDS-PAGE凝胶(5%浓缩胶和10%分离胶)。将配制好的SDS-PAGE胶安装至电泳槽内，加入甘氨酸电泳缓冲液，向加样孔中加入蛋白分子量标准和蛋白样品，设定电压60 V，约40 min后，调节电压至120 V，至溴酚蓝达到底端。将PVDF膜用甲醇活化30 s后，按照从下到上将3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸的顺序放置在半干转膜仪上，恒流电流大小为膜面积的2倍，转膜1 h。 转膜结束后，将PVDF膜置于过氧化氢溶液中，室温孵育20～30 min。TBST洗3次。用5%的脱脂牛奶封闭1 h。用TBST溶液稀释血清样品，稀释比例1∶100。将PVDF膜置于塑料封膜袋内，注入稀释后血清，4 ℃孵育过夜。取出PVDF膜，TBST洗3次。用TBS溶液稀释Anti-Human IgE HRP抗体，室温孵育1 h后，TBST洗3次。在暗室中与发光液反应3 min后，在X光胶片上曝光，显影、定影后观察。

1.6 统计学处理

实验数据的统计学分析采用 GraphPad Prism 6 软件进行。统计后的数值结果以(均数±标准差)为呈现形式。两组数据之间差异使用t检验进行分析。

2 结果

2.1 呼吸道过敏患者血清存在抗樟树花粉特异性IgE

对非过敏者血清96份和呼吸道过敏且总IgE明显增高的患者血清122份，均进行樟树花粉特异性IgE ELISA检测，平均吸光度值分别为(0.054 07±0.000 368 7)和(0.054 49±0.001 050)，经统计学处理，二者之间没有显著性差异(t=0.342 2，bf=216，P= 0.732 5)。但是在呼吸道过敏且总IgE增高的患者血清中有2例樟树花粉特异性IgE明显增高，樟树花粉阳性率占总呼吸道过敏患者样本量的1.64%。图1A为患过敏性鼻炎32岁男性(樟树花粉ELISA吸光度值为0.163 8)，连续5年，每逢“五一”后一周开始出现鼻痒、发作性打喷嚏8～10个，在户外加重，症状持续1月余。变应原检查结果显示：总IgE为108 kU/L，户尘螨d1sIgE 13.20 kUA/L，粉尘螨d2sIgE 9.89 kUA/L，诊断为过敏性鼻炎。图1B为39岁女性，临床诊断为过敏性鼻炎伴哮喘(樟树花粉ELISA 吸光度值为0.104 2),主因常年发作性打喷嚏、流清涕伴气紧、呼吸急促3年，每年4～6月加重，发作频繁就医；实验室检查血清总IgE为526 kU/L, 户尘螨d1sIgE 47.20 kUA/L, 粉尘螨d2sIgE 43.30 kUA/L,诊断为过敏性鼻炎伴哮喘。这2例患者血清特异性IgE树木类花粉，如柏、榆、杨、柳、栎、桦、枫、胡桃、梧桐均为阴性；杂草类花粉，如豚草、艾蒿、雏菊、蒲公英、一枝黄花也均为阴性。由于32岁男性过敏性鼻炎患者血清中樟树花粉特异性IgE增高值为其他血清样本的3倍余，故判定其为强阳性。表明在门诊呼吸道过敏性疾病患者中确有对樟树花粉过敏者。

2.2 对ELISA阳性患者血清进行Western blot检测

对ELISA强阳性患者血清进行Western blot检测发现，患者血清IgE与相对分子质量为63 000和48 000樟树花粉蛋白分别发生了特异性反应，而阴性对照血清中未检测到这些条带。将樟树花粉特异性IgE检测阳性者的血清与樟树花粉蛋白行Western blot分析，进一步证实了这些患者血清中存在樟树花粉特异性IgE(图2)。

图 1 ELISA血清樟树花粉特异性IgE筛选结果Fig 1 Serum scanning the specific IgE of Camphor pollen by ELISAA、B：樟树花粉血清IgE增高者

图 2 樟树花粉特异性IgE检测阳性者的Western blot验证Fig 2 Verification of the specific IgE of Camphor pollen by Wes-tern blotA：樟树花粉特异性IgE检测阳性者,血清来自于图1A; C：樟树花粉特异性IgE检测阴性者;Mr：相对分子质量

3 讨论

呼吸道过敏性疾病包括上呼吸道过敏性鼻炎、咽喉炎和下呼吸道过敏性气管炎、支气管哮喘,其发病机制是以IgE介导为主的速发型变态反应,其过敏原主要存在于患者生存的环境中，环境中的气传花粉是诱发某些呼吸道过敏的重要因素。人们赖以生存的环境随着植被和人工绿化树种的变化，空气中的致敏花粉也随之发生变化。

在过去几十年里，世界上许多地区的过敏性疾病发病率急剧增加，成为卫生保健的重大挑战[5]。 过敏性鼻炎和支气管哮喘等过敏性疾病的发病率与城市化水平密切相关，而气传致敏花粉则被认为是更直接的原因。 来自韩国的1项2003至2011年的调查研究表明，空气花粉指数和过敏性疾病门诊就诊量明显呈正比[6]。 本课题组也发现门诊呼吸道过敏患者总数随着空气中气传致敏花粉数量的增多而有所增加[7]。 有统计表明，几乎所有的植物类的花粉都有可能成为特殊人群的致病变应原[8]，从而引发花粉症。空气中气传花粉浓度增高，过敏性疾病显著增加，特别是 “花粉症”的发病率明显升高[9]。随着城市绿化面积的增大, 气传花粉过敏原也随之增多, 居住在城市的居民花粉症的发病率也呈不断上升的趋势。 最新研究证实，绿地覆盖率增加10%，哮喘和变应性鼻炎的发病率增加5.9% ～13.0%[10]。据报道美国花粉症的发病率大约为5%, 个别地方高达15%,欧洲有的国家发病率甚至高达20%。过去在中国南方地区关于花粉过敏的发病报道相对较少, 但近年来发病率呈现一种持续上升的趋势[11]。 因为植物的生长受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，不同地区间气传致敏花粉的种类和含量也有差异[12]。

在上海市的一些老城区，法国梧桐即悬铃木是主要的行道树，其花期较长，花粉传播较广，且已被多数学者证实具有致敏性。而在上海市一些新城区和街道，香樟和银杏则成为近些年的主要行道树，是否具有致敏性尚无定论。王班等[3]研究发现，在上海市闵行地区，每年4～6月份为樟树花粉飘散最多的季节，樟树花粉是春季空气中飘散的相对优势花粉。樟树每年春季大量散发极其微小的花粉颗粒，造成花粉污染。虽然大量的文献报道了国内外多种气传致敏花粉的种类、分布、变应原、致敏性及其治疗等研究，但是关于樟树花粉对人体致敏性的研究却鲜有报道。截至目前仅宋娟娟等[13]于2006年在樟树花粉中克隆到了一个泛变应原基因：profilin，提示樟树花粉可能诱发人类过敏反应。

2015年本课题组曾用樟树花粉致变应性鼻炎小鼠模型，证实了樟树花粉可以诱发小鼠变应性鼻炎，为樟树花粉的致敏性提供了实验依据[14]。

由于变态反应性疾病的发病及就诊具有滞后性，故本研究筛查樟树花粉季节前后5个月的呼吸道过敏患者血清中的樟树花粉特异性IgE抗体，以进一步确定人群中是否存在樟树花粉致敏的可能。首先，提取、分离、纯化樟树花粉蛋白，并用其对122例春季呼吸道过敏患者血清进行ELISA检测，结果发现2例患者血清阳性(阳性率占同期上呼吸道过敏患者的1.64%)，其中1例为强阳性。将强阳性血清再通过免疫印迹实验(Western blot)进行验证，发现相对分子质量63 000和48 000附近出现条带，证实樟树花粉的特异性IgE确实存在。

综上，本研究成功提取、分离、纯化了樟树花粉蛋白，在呼吸道过敏患者血清中首次发现了樟树花粉特异性IgE，证实樟树花粉参与呼吸道过敏性疾病的发生，对分析引起呼吸道过敏性疾病的变应原具有重要的临床指导意义，也为进一步研究樟树花粉的发病机制奠定了基础。