中性粒细胞胞外诱捕网参与系统性红斑狼疮并发动脉粥样硬化

赵敏，王芳芳，王学彬

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种好发于育龄期女性的全身性自身免疫性疾病，以皮肤、关节、肾脏等多系统受累及血清中具有多种自身抗体为其突出特点。随着诊疗手段的逐渐提高，SLE患者生存率明显改善。然而，值得注意的是，SLE患者心血管事件发生率显著增高[1]。同传统心血管疾病一样，动脉粥样硬化仍为其基本病理改变。目前认为，动脉粥样硬化以内膜内脂质的异常沉积和异常的炎症反应为特征[2]。在SLE患者中动脉粥样硬化被发现过早并加速发展，SLE并发动脉粥样硬化的病因是多因素的，其具体发病机制尚不明确，SLE中动脉粥样硬化的发生被认为是内皮细胞功能障碍、功能失调的脂质、血管壁的炎症过程、多种自身抗体的发展、传统的危险因素和狼疮本身治疗药物综合作用的结果[3]。在SLE中，中性粒细胞可能在诱导自身免疫反应和器官损伤中发挥重要作用。中性粒细胞贯穿整个炎症发展过程。目前认为，中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)作为中性粒细胞的一种独特的死亡方式，在SLE动脉粥样硬化慢性炎症过程的启动和维持中起重要作用，可通过多种机制参与其中。

1 SLE与动脉粥样硬化

Manzi等[4]研究了498例女性SLE患者与2 208名健康对照组女性的心血管事件发生率，在SLE确诊后有33例患者发生首次心血管事件，其中11例发生心肌梗死，10例发生心绞痛，12例发生心绞痛并发心肌梗死，事件发生时2/3的患者年龄在55岁以下；尤其是35～44岁亚组的女性SLE患者，发生急性心肌梗死的风险是健康对照组的50倍。有研究报道，与非SLE患者相比，SLE患者患冠心病的风险高3.39倍，即使在调整了潜在的混杂变量后，SLE的诊断仍然与冠心病风险增加独立相关[5]。SLE患者比普通人群有更高的心血管疾病风险，而且发生在较年轻的患者群体中。然而，大多数年轻女性没有明显的心血管疾病的传统危险因素，因此，不能简单的用Framingham风险方程中包括的经典风险因素来完全解释。持续的炎症以及免疫失调被认为在SLE患者的斑块进展和促进心血管疾病进展中起着关键作用。而SLE患者较高的心血管疾病风险主要与动脉粥样硬化加速有关，这导致与普通人群相比，其临床症状和表现出现更早。Henrot等[6]发表的一项荟萃分析显示，与健康对照组相比，SLE患者颈动脉内膜中层厚度明显增厚，颈动脉斑块发生率明显升高，血流介导的血管舒张功能显著降低，动脉粥样硬化发病率明显增高。Roman等[7]报道了各年龄组SLE患者动脉粥样硬化的发生率增加，尤其是40岁以下的患者，其发生率是健康对照组的5.6倍。

2 NETs概述

2004年，Brinkmann等[8]首次发现，中性粒细胞在激活后可释放出一种网状结构，被称为NETs，是由DNA、组蛋白、颗粒蛋白和胞浆蛋白等构成。NETs是一种不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡途径，其释放过程也被称为中性粒细胞胞外诱捕网形成(NETsosis)。NETsosis可分为以下几个过程：细菌毒素或表面受体(G蛋白偶联受体配体(GPCRs)、肿瘤坏死因子(TNF)和FC受体)的参与，激活中性粒细胞，启动NETsosis；可导致细胞内钙浓度增加，随后钙通道开放，内质网中储存的钙释放；蛋白激酶C等关键细胞周期调节因子激酶信号级联的激活，以及来源于NADPH氧化酶和线粒体的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生[9]；活性氧可以释放细胞核、颗粒和细胞质内容物，包括中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶，降解肽基精氨酸脱氨酶4诱导的组蛋白瓜氨酸化，并促进染色质解聚，组蛋白与颗粒蛋白混合并从中性粒细胞中排出[10]。以上过程均对NETsosis起关键作用。中性粒细胞可以通过NETs杀灭病原体，而NETs增多提示机体组织受损，目前更多的关注在其与炎症与免疫疾病的发生和维持之间的关系。

3 NETs参与SLE动脉粥样硬化

3.1 NETs损伤内皮细胞功能

内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化启动的最早步骤之一。在持续炎症刺激下内皮细胞活化，活性氧生产增加，血管通透性增加、脂质积聚和免疫细胞募集，产生肿瘤坏死因子等多种促炎细胞因子，启动动脉粥样硬化[11]。SLE患者有显著的内皮功能受损，其强大的血管修复功能也明显下降。与NETs-患者相比，NETs水平升高(NETs+)的SLE患者内皮细胞微粒增多，而血浆内皮细胞微粒水平与循环NETs水平呈正相关，表明内皮损伤和NETs之间存在联系[12]。NETs对内皮细胞也有直接损伤作用。SLE的NETs中金属基质蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)上调，MMP-9特异性地损害了小鼠主动脉内皮依赖性的血管舒张，并诱导内皮细胞凋亡，改变内皮细胞的功能完整性；此功能与MMP-9激活内皮金属基质蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)有关，抑制MMP-2活化可恢复内皮依赖功能，降低NETs诱导的血管细胞毒作用。此外，MMP-9可能是SLE中一种新的自身抗原，在SLE血清中检测到由MMP-9和抗MMP-9组成的免疫原性复合物，可以诱导NETsosis增多，进一步损伤内皮[13]。这可能与SLE动脉粥样硬化发病机制有关。中性粒细胞/胞外陷阱介导的内皮细胞损伤部分依赖于活化的内皮细胞产生的白介素-8[14]。动脉粥样硬化患者血清白介素-8和NETs水平明显升高[15]。白介素-8与其受体CXC趋化因子受体2(CXCR2)在中性粒细胞上相互作用，通过Src、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导形成NETs，加重体内动脉粥样硬化进展。激活的中性粒细胞诱导的NETosis直接上调巨噬细胞TLR9/NF-κB通路，进而启动白介素-8的释放。在动脉粥样硬化进展过程中中性粒细胞与巨噬细胞相互作用，并表明NETs是治疗动脉粥样硬化的一个新的靶点。

3.2 低密度粒细胞促进NETs形成，发挥促炎作用

低密度粒细胞(low-density granulocytes，LDGs)是在SLE患者中发现的中性粒细胞的一个亚群，LDGs具有强大的促炎作用。低密度粒细胞是未成熟的中性粒细胞，在促炎细胞因子白介素-8和白介素-17的影响下过早离开骨髓，在全身定居。这些细胞在体外系统中迅速发生凋亡，并且容易发生NETsosis[16]。研究发现，SLE患者组与健康对照组的正常密度的中性粒细胞相比，LDGs具有更强的杀伤内皮细胞功能，能够促进肿瘤坏死因子分泌，受到刺激时，浆细胞样树突状细胞合成干扰素-α的能力增强，促进和增加组织损伤[17]。多种炎症细胞因子在动脉粥样硬化斑块区域高表达。肿瘤坏死因子可促进动脉炎症及内皮细胞功能障碍，刺激单核细胞分化为巨噬细胞和泡沫细胞；能诱导黏附因子表达，加快T细胞、单核细胞到内皮细胞的募集，可能是SLE相关心血管疾病的重要因素[18]。最近的一项研究证实，与健康对照组相比，只有SLE中LDGs能够诱导Th1型促炎细胞因子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等，并且证实LDGs与干扰素基因特征存在直接正相关，也提示LDGs与干扰素-I途径的激活密切相关[19]。干扰素在SLE发病机理中起致病作用，主要由浆细胞样树突状细胞产生。浆细胞样树突状细胞和干扰素-α合成的激活显著加速了动脉粥样硬化的发展。SLE患者血清干扰素活性与血流介导的舒张功能降低、动脉内膜中层厚度升高和冠状动脉钙化严重程度独立相关[20]；与SLE患者内皮细胞功能障碍相关，导致内皮祖细胞耗竭，可能与SLE心血管风险增加有关[21]。另外LDGs具有自发形成NETs倾向，具有更高的合成NETs的能力，SLE中LDGs以线粒体衍生的超氧化物依赖的方式自发释放富含氧化线粒体DNA的NETs，导致促炎能力增强，进一步刺激浆细胞样树突状细胞合成和释放干扰素-α[22-23]。LDGs与干扰素之间形成恶性循环，这种恶性循环也被认为是SLE并发动脉粥样硬化干预治疗的潜在靶点。LDGs在外周血液中表达的基因信号水平明显高于正常密度的中性粒细胞，LDGs基因特征与SLE中血管损伤和不稳定的冠状动脉斑块有关，也支持LDGs与SLE心血管疾病相关性的假说[24]。

3.3 NETs促进血栓形成

不稳定动脉粥样硬化斑块破裂，可导致血栓形成。在血栓出血部位检测到NETs明显富集，是血小板和红细胞以及纤维蛋白的主要支架。NETs显著影响动脉粥样硬化的开始和发展，并且可以诱导和促进动脉血栓的形成、稳定和生长[10]。NETs中的多种成分与血栓形成有关。NETs的DNA成分激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)，启动级联反应(与凝血因子Ⅺ一起)，最终导致凝血酶的形成；NETs中的组蛋白激活血小板，隔离血栓调节蛋白和蛋白C等抗凝分子；NETs中的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶，裂解抗凝血分子组织因子途径抑制物和抗凝血酶，还通过多种途径激活血小板；最后，NETs作为支架组装和聚集血小板和红细胞(RBC)，致使血栓形成[25]。NETs的关键成分——核小体(DNA-组蛋白复合物)和双链DNA(DsDNA)，病变部位的水平明显升高，被认为是心血管事件的敏感生物标志物，也与冠状动脉血栓NETs负荷相关[26]。组织因子/凝血酶轴在SLE炎症性血栓中起关键作用；活动期SLE患者NETs表达组织因子和白介素-17A，活动期SLE患者NETs形成的组织因子具有生物活性，可以促使网状结构增加凝血酶水平[27]。从尸检档案中提取30例急性心肌梗死患者64个石蜡包埋的冠状动脉斑块节段，其中复杂斑块44个(斑块内出血 17个，糜烂9个，破裂18个)，完整斑块20个。根据血栓或出血的组织学年龄，通过免疫组织化学染色显示中性粒细胞(抗髓过氧化物酶、抗弹性蛋白酶和抗CD177)和NETs(抗瓜氨酸组蛋白-3和抗肽基精氨酸脱亚胺酶-4)。结果显示中性粒细胞和NETs在所有类型的复杂斑块中均大量存在，其程度无明显差异。但在完整斑块中不存在，而复杂但不完整斑块的邻近血管周围组织也含有大量的中性粒细胞和NETs[28]。这可能促进血栓形成或出血性并发症的进展，影响血栓块的进展及稳定性，从而导致随后的临床冠脉缺血综合征的发生。肽基-精氨酸脱亚胺酶-4和DNase是该过程中的关键酶。一项NZM小鼠的研究显示，经DNase处理后颈动脉血栓含量下降，抑制肽基-精氨酸脱亚胺酶-4可以抑制中性粒细胞的NETs形成，延长血管闭塞时间，显著减轻NZM小鼠的促血栓表型[29]。因此，抑制NETs形成的关键步骤或增加其降解，可能有助于预防及治疗血栓形成。

3.4 NETs介导高密度脂蛋白氧化，损害胆固醇流出能力

SLE中的血脂异常主要表现为高密度脂蛋白水平降低，低密度脂蛋白水平高或不变，被称为“狼疮型”血脂异常。在氧化应激作用下，低密度脂蛋白形成氧化低密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白具有高度促炎性。McMahon等[30]描述了高密度脂蛋白本身具有抗炎及抗氧化的作用，可在急性反应时具有促炎能力，保护低密度脂蛋白抗氧化能力减弱，清除胆固醇能力下降；研究中发现44.7%的SLE患者具有促炎性高密度脂蛋白，相比对照组升高了4.1%，而且氧化型低密度脂蛋白水平与促炎症高密度脂蛋白水平相关；异常高密度脂蛋白损害了低密度脂蛋白氧化的能力，可能导致动脉粥样硬化形成。高密度脂蛋白介导的胆固醇外流是防止泡沫细胞和动脉粥样硬化产生的重要因素。NETs与胆固醇流出能力密切相关，尤其是LDGs形成的NETs。研究证明LDGs与胆固醇流出能力成负相关，认为中性粒细胞可能破坏高密度脂蛋白功能，从而促进SLE动脉粥样硬化的形成[24]。SLE患者血液中NETs水平升高，同时具有髓过氧化物酶(MPO)、NADPH氧化酶(NOX)和一氧化氮合酶(NOS)等多种氧化酶；SLE中LDGs形成的NETs可能是细胞外氧化酶的重要来源，多种氧化酶会对高密度脂蛋白进行氧化修饰，从而降低其有益的胆固醇流出能力，致使动脉粥样硬化形成[31]。

综上所述，中性粒细胞在炎症及免疫性疾病中起着非常重要的作用。最近越来越多的研究表明NETs参与SLE中动脉粥样硬化的形成。NETs可能通过损伤内皮、促进血栓、介导脂质氧化等途径参与SLE动脉粥样硬化发展，尤其是LDGs形成的NETs。尽管研究存在挑战，但NETs研究有望为改善SLE心血管疾病的诊断和治疗提供依据。NETs可能作为早期监测及干预SLE合并动脉粥样硬化的生物标记物和潜在靶点，以减少动脉粥样硬化的发生及血栓的形成。但NETs的重要性仍有争议，仍需要更多的基础及临床的探索性研究(图1)。

图 1 NETs参与SLE动脉粥样硬化进展机制Fig 1 NETs participate in the progression of atherosclerosis in SLE

目前关于NETs的研究更多基于动物模型，在SLE患者群体中涉及较少。对于NETs在自身免疫性疾病发病机制中的作用研究仍处于探索阶段，尚有许多问题需要解决。未来寻找简单可靠的方法评估NETs以及找到清除NETs的手段极为重要，对于评估其对人类免疫系统疾病的诊治意义，很有价值。