乙酸铅与邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯联合染毒对小鼠学习记忆能力的影响

李聪，代霖，付朝旭，朱雯菲，金银燕，全昶林，许妍姬

延边大学医学院预防医学教研部，延吉 133002

随着经济的高速发展，无论是生活还是生产方面，塑料制品得以大量使用[1-2]。在塑料制品的生产工艺中，为了增加塑料材质的延展性和可塑性，生产过程中往往需要添加邻苯二甲酸酯类(phthalates acid esters, PAEs)作为增塑剂。随着人类生活质量和安全意识的提高，增塑剂的毒性效应逐渐受到关注。增塑剂中，邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)是目前使用最为广泛的PAEs有机化合物，被广泛应用于涂料等建筑材料、食品包装材料、儿童玩具、办公用品、化妆品和医疗器材等塑料产品中[3-5]。研究发现，DEHP是一种环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptor, EED)，对机体有生殖毒性、肝脏毒性、免疫毒性以及神经毒性等多种毒性作用，DEHP的毒性研究也越来越受到学者们的关注[6-12]。

铅是一种用途广泛的重金属，在生活和工业生产中处处可见。铅作为一种重要的成分参与塑料制品的生产过程。聚氯乙烯是一种极性高分子，受热易分解，产生氯化氢。为解决这个问题，就必须采用热稳定剂。常用的热稳定剂有铅盐类、金属皂类、有机锡类和复合稳定剂等。其中，因原料易得价廉、生产工艺简单，铅盐热稳定剂广泛应用[13]。随着铅的广泛应用，铅污染严重影响环境和人体健康，铅中毒主要表现为神经毒性。Pb和DEHP的单一毒性研究已经得到众多学者的研究证实[14-21]。

日常生活中，人体可以通过多种途径同时暴露于DEHP和Pb环境中，但现有的研究还仅局限于DEHP和Pb单一污染物对动物的毒性，缺乏二者联合毒性实验研究。因此，本实验将二者联合染毒，进一步研究DEHP和Pb的联合作用及机制。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验动物

DEHP和Pb均采用体内染毒，选择80只健康雄性适龄SPF级昆明小鼠(8周龄，体重为(20±2) g)，由延边大学动物科学实验中心提供。为减少实验动物个体差异，保证各组实验结果的均衡性和准确性，实验前按照初始体重进行平均分组。在延边大学医学院动物饲养房集中饲养，光、暗周期交替，保持清洁，无其他病原体环境，温度控制在22～25 ℃，相对湿度保持在40%～70%，采用由延边大学动物科学实验中心提供的普通饲料喂养，小鼠可以自由饮水、饮食，每日记录其饮水量和饮食量。在实验正式开始前，将小鼠放在正常饲养环境3 d。

1.2 实验试剂与仪器

主要实验试剂：乙酸铅(纯度99.0%，天津市化学试剂三厂)、邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯(纯度99.0%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)、吐温80(纯度99.0%，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

主要实验仪器：YP600型电子天平(上海精科天平，上海)、SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海生化仪器厂，上海)、全模终端过滤独立送风净化笼具(苏州工业园区唯亭姑秀实验动物设备厂，江苏)、Morris水迷宫(上海洛维生物科技有限公司，上海)、小动物避暗穿梭仪与跳台记录仪(众实迪创(北京)科技发展有限责任公司，北京)。

1.3 暴露实验

1.3.1 试剂配制

将DEHP与吐温80(Tween-80)按照体积为1∶1助溶，并使用双蒸水配制成浓度为10、50和200 mg·kg-1的染毒液。将乙酸铅用双蒸水溶解配制成1 g·L-1，用于铅组饮水染毒。

1.3.2 实验分组与模型建立

选用80只昆明种小鼠，雄性，体重为(20±2) g。实验前，为减少个体差异而影响实验分组差异，采取称量初始体重，按照体重大小平均分为8组，每组各10只，分组见表1。

表1 实验分组Table 1 Experimental grouping

每天在固定的时间，DEHP处理组按照0.1 mL·(10 g)-1的剂量对小鼠灌胃给药，CT组和Pb组按照相同比例的剂量给予双蒸水(DDW)灌胃以作为安慰剂。铅组用1 g·L-1乙酸铅通过自由饮水进行染毒，CT组和DEHP组采用双蒸水自由饮水。联合染毒处理组用1 g·L-1乙酸铅通过自由饮水染毒，且按照0.1 mL·(10 g)-1的剂量对小鼠灌胃给药DEHP。所有各组均自由进食。连续染毒6周，实验周期共计50 d。实验期间，每天观察小鼠的毛色、呼吸和状态，并记录各组小鼠体重、进食量以及饮水量。

1.4 动物行为学实验

1.4.1 小鼠Morris水迷宫实验

实验周期的第6周进行小鼠Morris水迷宫训练，训练期间照常按时给药。水迷宫由直径1.2 m的圆形水池构成，水池中安置有9 cm平台，由顶部摄像头进行录像拍摄，通过视频分析系统统计分析实验结果。设定水池分为4个象限，第一、第二和第三象限分别在池壁设置固定投放点，平台位于第四象限。水池水位位于平台上1 cm，实验全程，保持水温在(25±1) ℃。

标点指引实验：分别从第一、第二和第三象限的固定位置将小鼠面朝水池壁，头朝上，投入水中，并同时启动摄像机录像功能，时间60 s。记录小鼠从不同象限游上平台的时间，所测得的时间称逃避潜伏期。如果60 s内，小鼠未能成功游上平台，则需要通过引导棒引导小鼠上台，让小鼠停留在平台10 s，增强学习记忆力。实验每隔24 h训练一次，连续训练6 d，测定小鼠空间学习能力。

平台寻找实验：在连续训练6 d后，间隔24 h，撤去平台，将小鼠从平台所在象限的对角象限第二象限固定点位置投放水中，同时启动摄像机录像系统记录数据。记录小鼠的游泳路线，统计穿台次数和目标象限停留时间，测定小鼠空间记忆能力[22-23]。

1.4.2 小鼠跳台实验

在实验开始前，把小鼠先放入跳台测试仪中，使小鼠适应仪器密闭环境3 min。将电压设定在36 V的交流电上，将小鼠放在跳台仪中的平台上，然后开启仪器，记录数据。仪器自动记录小鼠第一次从绝缘平台跳下的时间，即为相应小鼠的潜伏期数据。连续记录5 min，小鼠从台上跳下受到电击的次数，即为错误次数。学习成绩阶段：记忆获得阶段结束24 h后进行，再次进行小鼠跳台实验，记录跳台潜伏期和5 min内跳台错误次数。

1.4.3 小鼠避暗实验

小鼠避暗实验分为记忆获得阶段和学习成绩阶段[26]。记忆获得阶段：实验正式开始记录前，将小鼠先放入明箱中使其适应仪器明箱环境3 min，暗箱不通电，小鼠可在明暗箱之间自由活动。适应结束后，将小鼠面部背朝洞口放入明箱中，将电压设定为36 V，启动仪器进行测定。记录小鼠第一次从明箱通过洞口到达暗箱受到电击所用的时间，即为潜伏期。持续记录5 min，记录小鼠从明室穿梭到暗室受到电击的次数，即为错误次数。学习成绩阶段：记忆获得阶段24 h后，再次进行实验，记录避暗潜伏期和5 min内避暗错误次数。

1.5 生物学指标的测定

1.5.1 实验动物处理

行为学实验周期结束后，将各组小鼠禁水禁食12 h，然后称量各小鼠体重，并采取颈椎脱臼法处死小鼠，解剖并称量小鼠脑组织(大脑)、心脏、肺、肝脏、脾脏和肾脏，计算其各脏器系数。

1.5.2 脑组织匀浆制备及蛋白含量的测定

通过机械扣脑方法，将小鼠大脑完整取出，置于冰上，去除脑组织表面血液，并准确称量脑组织重量，按照脑组织重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入生理盐水，在冰浴条件下，用匀浆器机械匀浆，制备成10%的脑组织(大脑)匀浆液，放入低温离心机内，2 500 r·min-1离心10 min，收集上清液。

在西方国家，从实质意义上而言，个人本位与社会本位是没有多大区别的，因为，西方人是在充分实现个人权利的基础上，全力实现整个社会的公共利益。由此可见，西方的个人本位与社会本位，没有实质的差异，绝不是中国人所理解的非此即彼的关系，更不具有道德的高低之分。然而，在中国，个人本位与社会本位却因社会环境的因素，成为水火不容的对立局面。从一定程度来说，还是国人并不理解个人本位与社会本位的实质内涵，以及误解了西方个人本位与社会本位的关系，错误地把社会本位作为一切的重心，完全抛弃了个人本位的价值。其实，推崇社会至上的理论，抹杀个人权利，迎合中国千年的所谓王道精神是极为愚蠢和愚昧的。

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法和步骤，准确操作，通过计算标准品的吸光度，制作蛋白标准曲线(R2>0.99)，通过蛋白标准曲线方程，计算各脑组织的蛋白浓度。

1.5.3 脑组织生化指标测定

按照试剂盒说明书，取适量脑组织匀浆液分别测定丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、一氧化氮(NO)含量、总抗氧化能力、单胺氧化酶(MAO)活性和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。通过测定结果，推断各组小鼠脑组织损伤程度。

1.6 效应相加模型

本实验采用效应相加模型[27]进行联合毒性评价分析。该模型假设2种物质之间不相互作用，通过比较化合物混合处理后实测值与理论值之间的统计学差异(P值)，判断2种化合物的联合效应。

理论值是指2种物质单独毒性效应之和，实测值为2种物质联合作用实际测得的毒性效应。对实测值和理论值进行单因素方差分析，当实测值与理论值之间没有显著性差异时(P>0.05)，说明2种物质互不影响，联合作用表现为相加作用。当实测值与理论值之间具有统计学差异时(P<0.05)，如果实测值显著低于理论值，则表示二者存在拮抗作用；如果实测值显著高于理论值，则表示二者为协同作用。

1.7 统计分析

2 结果(Results)

2.1 小鼠体重及脏器系数

2.1.1 各组实验小鼠观察结果

各组小鼠经灌胃后，立即观察到，小鼠活动均减少，DEHP高剂量组小鼠部分出现胃痉挛和呕吐等现象。CT组和Pb组恢复正常活动的时间相对较短，随着DEHP浓度增高，小鼠恢复正常活跃度的时间延长。实验周期结束后，各组小鼠的皮毛光滑。整个实验周期中，小鼠大小便无异常，眼、鼻和口腔均无分泌物。通过灌胃染毒，小鼠没有发生运动失调等症状，呼吸和饮食饮水均正常，无死亡现象。将小鼠处死后，观察腹腔各脏器，各脏器均无明显异常。各组小鼠的摄食量和饮水量无明显差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组实验观察结果Table 2 Experimental observation results of each group

2.1.2 各组实验小鼠体重的变化

分别取实验周期中每周末小鼠体重，进行相互比较，无明显差异(P>0.05)(表3)。

表3 各给药组实验小鼠体重的变化Table 3 Changes in body weight of experimental mice in each drug-administered group

2.1.3 各组实验小鼠脏器系数比较

处死小鼠前，称量小鼠体重，解剖小鼠，取脑、肺、肝、脾、心和肾，称量各脏器的重量，计算各脏器系数。比较各组小鼠的肺、脾、心和肾的脏器系数，无明显差异(P>0.05)；各组小鼠脑组织重量，随着DEHP浓度增加，逐渐降低，与CT组和Pb组相比，DEHP2+Pb组和DEHP3+Pb组均有差异(P<0.05)；随DEHP浓度升高，肝脏重量在中剂量DEHP处理组和中剂量联合处理组中降低，与CT组和Pb组相比，DEHP2组和DEHP2+Pb组均有差异(P<0.05)。与单独染毒组相比，高浓度联合染毒组毒性效应显著增强，按效应相加模型对联合作用方式进行评价，实测值大于理论值，联合作用表现为协同作用(P<0.05)(表4)。

表4 各组实验小鼠脏器系数比较Table 4 Comparison of organ coefficients of experimental mice in each group

2.2 行为学实验结果

2.2.1 小鼠Morris水迷宫实验结果

各处理组小鼠逃避潜伏期，与空白对照组相比，随着DEHP浓度增高，逐渐延长(P<0.05)；联合染毒组分别与DEHP组、Pb组比较，可知联合染毒后小鼠逃避潜伏期延长明显(P<0.05)。DEHP和Pb染毒对小鼠空间学习能力有不同程度的损害(表5)。

表5 Morris水迷宫实验各组小鼠逃避潜伏期Table 5 The mice escape latency of each group in Morris water maze punctuation guide experiment

Morris水迷宫实验各组小鼠游泳速度无明显差异(P>0.05)。结果表明，排除各组小鼠的个体差异，染毒处理对各组小鼠体能无明显影响(表6)。

表6 Morris水迷宫实验各组小鼠游泳速度比较Table 6 Comparison of swimming speeds of mice in the Morris water maze

Morris水迷宫平台寻找实验结果显示，空白对照组的小鼠在目标象限停留时间最长，小鼠在目标象限的游泳距离占总游泳距离的比例最高，穿台次数最多；随着DEHP浓度的增高，上述实验数据值降低；高浓度联合染毒实验结果最低，空间记忆能力障碍明显(P<0.05)。与单独染毒组相比，高浓度联合染毒组毒性效应显著增强，按效应相加模型对联合作用方式进行评价，实测值大于理论值，联合作用表现为协同作用(P<0.05)(表7)。

表7 Morris水迷宫实验各组小鼠平台寻找实验结果Table 7 The results of finding the platform in each group in Morris water maze experiments

由小鼠在平台寻找实验中的游泳轨迹来看，空白对照组小鼠记忆能力最强，在水迷宫中目的性很强，游泳轨迹多集中于目标象限，并多次穿越目标平台；随着DEHP浓度的增高，小鼠的游泳轨迹逐渐变得无目的和不规则；高浓度联合染毒组小鼠的游泳轨迹则杂乱无章，多为无目的性探索(图1)。

图1 小鼠平台寻找实验的游泳轨迹Fig. 1 The swimming trajectories of mice in platform finding task in Morris water maze experiments

2.2.2 小鼠跳台实验结果

小鼠跳台实验结果显示，各组小鼠记忆获得所用时间无明显差异(P>0.05)；各组小鼠学习成绩阶段所用时间，随DEHP浓度和联合染毒浓度的增高而降低(P<0.05)。高浓度染毒组小鼠的错误次数明显高于空白对照组，联合染毒组小鼠的学习记忆能力低于单一染毒组(P<0.05)(表8)。

表8 各组小鼠跳台实验结果Table 8 The experimental results of mice in each group of step down test

2.2.3 小鼠避暗实验结果

小鼠避暗实验结果显示，各组小鼠记忆获得潜伏期无明显差异(P>0.05)；各组小鼠学习成绩潜伏期，随DEHP浓度和联合染毒浓度的增高而降低，差异明显(P<0.05)。高浓度染毒组小鼠的错误次数明显高于空白对照组，联合染毒组小鼠的学习记忆能力低于单一染毒组(P<0.05)。结果表明，联合染毒对小鼠的学习记忆能力影响更大(表9)。

表9 各组小鼠避暗实验结果Table 9 The experimental results of mice in each group of darkness test

2.3 脑组织生化指标测定结果

小鼠脑组织各生物学指标测定结果显示，与CT组和Pb组相比，单独DEHP处理组中，CAT活性、GSH含量和总抗氧化能力随着DEHP浓度增加逐渐降低，联合染毒组与Pb组和对应剂量DEHP染毒组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，表10)。单独DEHP处理组与对照组比较，随着DEHP浓度增加NO含量、MDA含量、MAO活性和AchE活性逐渐增加，联合染毒组与Pb组和对应剂量DEHP染毒组比较上述4个生化指标明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，表11)。与单独染毒组相比，中、高浓度联合染毒组毒性效应显著增强，按效应相加模型对联合作用方式进行评价，实测值大于理论值，联合作用表现为协同作用(P<0.05)。

表10 小鼠脑组织抗氧化指标测定结果Table 10 Results of antioxidant index in mouse brain tissue

表11 小鼠脑组织NO、MDA、MAO和AChE活力测定结果Table 11 Results of NO, MDA, MAO and AChE activity in mouse brain tissue

3 讨论(Discussion)

DEHP是目前使用最为广泛的增塑剂，铅盐作为重要的热稳定剂被广泛应用于塑料制品的生产过程中。人体可以通过多种途径暴露于DEHP和Pb环境中，但是现有的研究还仅局限于DEHP和Pb单一污染物对动物的毒性[28-35]，缺乏二者联合毒性研究。因此，研究两者的联合毒性效应及其发生机制具有重要意义。

本研究发现，DEHP和Pb染毒对小鼠体重、每日摄食量和每日饮水量影响不明显。各处理组中小鼠的肺脏、脾脏、心脏和肾脏无明显损伤；随着染毒浓度增加，脑组织重量逐渐降低，且联合染毒组更明显；肝脏重量随着DEHP浓度升高，在中剂量时降低，在高剂量时有所增加，提示DEHP对肝脏具有毒性作用，并可能在肝脏产生富集作用。行为学实验结果表明，染毒处理对小鼠的空间学习能力损害明显，导致小鼠空间记忆能力障碍。联合染毒组神经毒性作用明显高于各单一染毒组，用效应相加模型进行评价，表现为协同作用。

为探究其毒性增加是否和氧化损伤相关，分别对MDA、NO、CAT、GSH和总抗氧化能力等氧化损伤指标和MAO、AchE等神经递质类指标进行测定。随着DEHP浓度增加，脑组织中MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性逐渐增加，联合染毒组MDA含量、NO含量、MAO活性和AchE活性增加明显，脑组织中CAT活性、GSH含量和总抗氧化能力逐渐降低，联合染毒组与Pb组和对应剂量DEHP染毒组相比，CAT活性、GSH含量和总抗氧化能力降低明显。可见，染毒处理导致小鼠脑组织中活性氧增加，清除速率降低，且活性氧作用被放大，抗氧化能力降低，引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡；联合染毒后细胞损伤明显，中枢神经系统脑血流量调节障碍，并引发组织细胞产生神经毒性作用，脑组织发生氧化应激反应，从而降低学习记忆能力。MAO和AchE是分解单胺类神经递质和乙酰胆碱类神经递质的活性酶，染毒处理可影响MAO和AchE活性，从而导致脑组织中单胺类神经递质和乙酰胆碱神经递质减少，导致学习记忆能力障碍。DEHP和Pb联合染毒的毒性效果增加，用效应相加模型进行评价，表现为协同作用。

相关研究表明，DEHP和甲醛联合染毒，小鼠学习和记忆能力较单一染毒组受损明显，其联合毒性具有一定的增强作用[36]。DEHP能影响外周葡萄糖和胰岛素稳态，导致海马胰岛素代谢紊乱，与阿尔茨海默病存在潜在关联[37]。本实验结果表明，DEHP可导致学习记忆能力障碍，当与铅联合染毒后，脑组织氧化损伤加重，导致学习记忆能力障碍更为明显。

所有实验结果，应用效应相加模型进行评价，结果表明，DEHP和Pb联合毒性并非简单的相加作用，表现为协同作用。由于两者在生活中极易接触，二者的联合作用还需要从分子毒理学的角度进行深入研究。

目前，联合作用的评价方法大多数采用2个基本模型，包括效应相加模型[38]与剂量相加模型[39]。本研究采用的效应相加模型评价方法，统计学分析方法简单，实验操作简便易行。方法中将实测值和理论值进行直观比较，进一步保证了结果的可靠性。但该方法也有不足之处，完全基于受试物某个特定浓度点产生的单独及联合效应值的统计学比较，缺少一定的浓度效应关系依据。国内外对于联合作用的评价方式尚不统一，联合毒性作用具有特异性，因此，采用不同的评价方式进一步开展研究并从分子学角度进行验证很有必要的。