应用比较毒理基因组学数据库解析尼泊金酯毒理学通路

张纪亮，王力军，谢嘉，洪美玲，丁利，李二超，刁晓平,*

1. 海南师范大学热带岛屿生态学教育部重点实验室，海口 571158 2. 海南大学海洋学院，海口 570228

大数据时代的来临对实验科学，包括毒理学，产生了重大影响。通过对海量数据的研究分析来探索其中的规律，可以直接提出假设，并有可能为得出可靠的结论提供重要参考依据。自2004年发布以来，比较毒理基因组学数据库(CTD)(http://ctdbase.org)已经发展成为一种重要的毒理信息学资源[1]。CTD数据库通过将文献资料中的信息(如文本、表格、数字和补充文件等)转换成为带注释的信息，将不同的数据标准化并组织成结构化的格式，使其具有内聚性、可管理性和可计算性。CTD核心内容来自3个综合模块：毒理基因组模块(包含超过170万个化学物质-基因/蛋白质相互作用的信息)、疾病模块(包含超过245 000个化学物质-疾病和基因-疾病相互联系的信息)、暴露模块(包含超过111 000个与环境胁迫、受体、生物标志物和有害结局等相关的描述)[1]。在CTD数据库中，由于词汇表、基因符号、基因注释和疾病等信息的标识化，使得这些信息可以被交叉整合，从而获得新的发现。因此，通过对CTD数据的手动策划，有可能发现新的和全面的环境污染物暴露的毒性效应和分子机制。

尼泊金酯(parabens)，又称对羟基苯甲酸酯，被广泛用于药物和食品保存的抗微生物剂[2]。在这些化合物中，常用的包括尼泊金甲酯(methyl paraben, MeP)、尼泊金乙酯(ethyl paraben, EtP)、尼泊金丙酯(propyl paraben, PrP)、尼泊金丁酯(butyl paraben, BuP)和尼泊金苄酯(benzyl paraben, BzP)。尼泊金酯化合物作为防腐剂，已应用于超过22 000种化妆品中，单一化合物浓度高达0.4%，而多化合物混合浓度高达0.8%[3]。尼泊金酯化合物已经在食品中使用了几十年，浓度高达0.1%，并且包括MeP、PrP和BuP在内的几种尼泊金酯化合物作为调味剂和佐剂直接添加到食品中[4]。Liao等[5]对我国各类食品中尼泊金酯化合物进行检测，检出率高达99%，尼泊金酯总浓度最高达2 530 ng·g-1，尼泊金酯在各类食品中的总平均浓度为39.3 ng·g-1，其中，MeP、EtP和PrP是食品中最主要的尼泊金酯，分别占总浓度的59%、24%和10%。大量研究表明，尼泊金酯类化合物广泛存在于人体尿液、血清、胎盘、乳腺肿瘤组织和脂肪组织中[6-8]。目前，尼泊金酯化合物在地表水中广泛存在，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的水平最高分别可达27 500、30 500、52 100、19 900和31.0 ng·L-1[9]。我国黄河表层水中尼泊金酯总浓度为3.31～55.2 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均浓度分别为8.84、0.359、5.44、0.233和0.080 ng·L-1；淮河表层水中尼泊金酯总浓度为15.0～164 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均浓度分别为51.7、0.361、6.48、0.082和0.104 ng·L-1[10]。尼泊金酯类已被确定为新型污染物，其对生态和人类健康的影响一直备受科学家和公众的关注。在生物体内，许多化学物质能够影响一个以上的生物过程；同时，不同的化学物质可能同时影响生物相似的生物过程。因此，在本研究中，拟通过CTD数据库，分析和比较5种常见的不同的尼泊金酯化合物对生物过程影响的机制，以期为之后的相关研究提供启发和思路。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 数据来源

本研究根据2018年8月CTD更新的数据进行分析。更新后共计有38 344 568交互作用信息。核心CTD包括了1 812 207个化学物质-基因相互作用信息，24 299 522个基因-疾病联系信息，2 507 429个化学物质-疾病联系信息，以及122 725个化学物质暴露信息。

1.2 CTD分析

进入CTD的界面后，应用Set Analyzer能够分析筛选出与MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相互作用的基因。将这些基因的NCBI symbols或IDs输入CTD的Set Analyzer中，应用Common gene-gene interactions功能，选择Bonferroni校正P值(默认0.01)，即可进行基因间相互作用网络分析。

1.3 维恩图制作

使用Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)软件，计算不同尼泊金酯类影响基因列表的交集，获得维恩图。

1.4 KEGG通路分析

进入DAVID网站(https://david.ncifcrf.gov/)后，选择“Start Analysis”，分别提交在CTD中筛选出的与5种尼泊金酯类相互作用的全部基因，设置校正的Fisher精确检验EASE分值为0.2。分析完成后，选择全部物种和“KEGG _ PATHWAY”，即可得出所需全部通路。

1.5 色阶表格制作

将数据导入Microsoft Excel后，对数据进行平方根化处理，选择“条件格式-色阶-红白色阶”，即得到红白色阶图。在相关基因表中，表格颜色越深，代表基因出现的频次越高；在KEGG通路表中，表格颜色越深，代表在该通路上富集的基因数目越多。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 相关基因分析

通过CTD数据库，获得与MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相关的基因个数分别为29、17、45、163和14。通过维恩分析，发现5种尼泊金酯类化合物共同影响的基因7个(表1和图1)。如表1所示，这7个基因分别是CCAAT增强子结合蛋白(CEBPA)、雌激素受体1(ESR1)、雌激素受体2(ESR2)、雌激素相关受体γ(ESRRG)、瘦素(LEP)、核受体共激活因子2(NCOA2)和过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARG)。这7个共同影响基因按功能大致可以2类。一类与脂代谢有关，如PPARG和CEBPA是前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的必需分子[11]；LEP则能够通过与体内多个信号分子相互作用，调控脂肪贮存、能量代谢和摄食行为等[12]。另一类为雌激素受体，雌激素受体在化学物雌激素样作用过程中发挥了重要的调控和介导作用[13]。另外，需要注意的是，核受体机制可能是尼泊金酯类重要的作用机制。在7个共同影响的基因中，5个基因为核受体(ESR1、ESR2、ESRRG和PPARG)或核受体共激活因子(NCOA2)。

图1 维恩分析比较毒理基因组学数据库中与MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相关的基因Fig. 1 Venn analysis for genes related to MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics Database

表1 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP共同作用的7个基因Table 1 Seven genes co-affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

在CTD数据库中，与所有的5种尼泊金酯类相互作用的基因共计190个。为了分析这些基因之间的相互联系，笔者进行了基因间相互作用网络的分析。如图2所示，除LEP外，其他5个尼泊金酯类共同影响基因(CEBPA、ESR1、ESR2、ESRRG、NCOA2和PPARG)均出现在基因相互作用网络图中。在基因相互网络图中，绿色圆点的面积越大、颜色越深，表明其代表的基因与其他基因的相互作用越强，越处于中心地位。可以看出，尼泊金酯类共同影响基因中的ESR1和ESR2均拥有较多关联基因，处于中心地位(图2)。这说明，对雌激素受体的干扰作用可能是5种尼泊金酯类化合物共同的重要毒性机制。体外研究表明，尼泊金酯类能够与ESR1和ESR2结合[14]，属于环境化学物的雌激素样作用的典型作用机制。尼泊金酯类与雌激素受体的亲和力比17β-雌二醇(E2)低几个数量级；BuP效力最强，比E2低约10 000倍[15]。尽管作用微弱，但由于不同尼泊金酯类在环境或人体中经常同时存在，它们之间还可能存在协同效应[16]，因此，尼泊金酯类化合物复合暴露风险的评估在今后研究中不容忽视。雌激素受体不管在雌性还是雄性动物的生殖中均具有重要作用。体内研究已经证实，尼泊金酯类能够诱导啮齿类动物子宫增生，干扰子宫组织学，影响雄性动物生殖参数[2]。

除了ESR1和ESR2，发现主要卵黄蛋白(MYP)(ID为373376)、肿瘤蛋白p53(TP53)(ID为7157)与神经营养受体酪氨酸激酶1(NTRK1)(ID为4914)在基因间相互作用网络中处于较中心的地位。MYP为非哺乳类卵生雌性动物的一种特异性蛋白，又称卵黄蛋白原(Vtg)[17]，是维持卵母细胞和胚胎发育的重要营养物质。在生态毒理学中，Vtg已经成为一种灵敏的环境雌激素和类雌激素效应的生物标志物。对MYP的干扰作用最终将影响动物的生殖和胚胎发育。TP53是一种广谱肿瘤抑制基因，其产物为多功能的转录调节因子，可以发挥调节细胞生长、细胞凋亡和DNA修复的作用[18]。事实上，尼泊金酯类化合物是在乳腺肿瘤中检出后，开始引起人们的关注[19]，并已证实，尼泊金酯可以在体外诱导MCF-7人乳腺癌细胞的增殖[20]。NTRK1介导神经细胞中神经生长因子信号传导的多个作用，如促进神经元的增殖或分化[21]。由于MYP、TP53和NTRK1不属于尼泊金酯类共同作用基因，无法推断所有尼泊金酯类是否都能够通过这3个基因分别介导生殖毒性、致癌性和神经毒性。但当所有的尼泊金酯类同时出现在环境或人体内时，可能诱导这些组合效应。

图2 应用比较毒理基因组学数据库分析与MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相关的所有基因间相互作用网络注：实线圈表示共同作用基因；虚线圈表示非共同作用基因，但处于较中心地位。Fig. 2 Network map of all genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics DatabaseNote: The solid circles represent co-acting genes; the dotted circles represent non-co-acting genes but locate in more central positions.

基于维恩分析和基因间相互作用网络分析的结果，尼泊金酯类化合物可能具有弱雌激素效应和干扰脂代谢毒性作用。因此，笔者分别整理了与尼泊金酯类化合物相互作用的与生殖(表2)和脂代谢(表3)相关基因。

表2 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影响的与生殖有关基因Table 2 Reproduction-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

表3 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影响的与脂代谢有关基因Table 3 Lipid metabolism-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

一般认为尼泊金酯类化合物的雌激素活性随着烷基链的长度(甲基<乙基<丙基<丁基<异丁基)而增加。因此，长链尼泊金酯类，如BuP和PrP最受关注[22]。根据表2的结果，与BuP相互作用的基因数量和出现频次均较高，其次是PrP。与BzP相关的基因数目最少，仅3个。值得注意的是，除雌激素受体外，BuP和PrP均能够和雄激素受体(AR)相互作用，MeP、BuP和PrP还能够与G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)相互作用。特别是GPER1，属于膜受体，不同于传统核受体(如ESR和AR)，其通过非基因组方式介导雌激素效应，可快速且持久地激活细胞内不同的雌激素信号通路，进而影响细胞的增殖及功能[23]。这提示，尼泊金酯类化合物通过激素受体介导的毒性机制的复杂性。除了性激素受体介导的毒性机制外，尼泊金酯类化合物还可能影响激素的合成与转运。MeP、BuP和PrP均能影响细胞色素P45019A1(CYP19A1)，其编码产物芳香化酶是雄激素转化为雌激素的限速酶，是雌激素合成的关键酶之一[24]；除BuP外，其他尼泊金酯类均能影响SHBG，其能够特异性地与性激素相结合并参与其转运，调控血液中生物活性性激素的水平[25]。

由表3可知，与BuP相互作用的与脂代谢有关基因数量和出现频次最高，其次是PrP和BzP。尽管与BzP影响的性激素有关基因数量和出现频次较低，但与其脂代谢有关的基因数量和频次却较高(表3)。根据筛选的脂代谢有关基因，可以推断，对脂肪细胞分化的影响可能是尼泊金酯类化合物影响脂代谢的主要作用机制。如前所述，共同影响基因PPARG和CEBPA是脂肪前体细胞分化的关键转录因子；而脂肪酸合成酶(FASN)是机体脂肪酸合成的主要限速酶，脂肪酸结合蛋白(FABP4)能够参与细胞内脂肪酸的转运和靶向定位，促进脂肪细胞的分化[26]。另外，脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是内源性大麻素系统的重要组成部分，也是内源性大麻类物质的水解酶[27]。内源性大麻素系统可调节脂肪生成和能量稳态[28]，内源性大麻素系统中的花生四烯酰乙醇酰胺可直接结合PPARG介导的脂肪细胞分化[29-30]。尼泊金酯类还能够影响脂肪因子的分泌，如LEP和脂联素(ADIPOQ)。LEP和ADIPOQ是脂肪组织合成的最丰富的脂肪因子，在能量稳态和食欲调节中起重要作用[31]。

2.2 相关KEGG通路分析

通过对富集基因个数>5的KEGG通路分析，筛选到大量与生殖相关通路，但并未筛选到与脂肪细胞分化相关的通路，如PPAR信号通路。有意思的是，在筛选出的通路中，有大量与神经系统或功能相关的通路。与BuP相关的神经系统或功能通路最多，还有少量通路与PrP相关。尽管仅发现BuP和PrP富集到与神经系统或功能相关的通路，但其他尼泊金酯类可能对神经系统也可能有相似的影响。最近的流行病学调查研究表明，孕妇尿液MeP和总尼泊金酯类水平与2岁时女童神经认知发育受损有关[32]。动物实验也表明，0.1 μg·L-1和1 μg·L-1的MeP暴露能够诱导斑马鱼(Daniorerio)幼鱼焦虑行为[33]；孕早期至断奶期暴露于BuP后，在诱导雄性仔鼠类似于自闭症VA模型中观察到的神经发育障碍[34]。最近有研究表明，尽管BuP暴露浓度低于影响生殖的最低可见有害作用水平(LOAEL)，并没有显示出雌激素活性和影响性腺发育和生育能力的效应，但却能够影响生殖行为[35]。这提示，神经-行为学较生殖相关指标可能对尼泊金酯类的暴露更加敏感。但相较于生殖毒性，尼泊金酯类神经毒性的研究还较少。因此，尼泊金酯对神经系统或功能的研究在今后应该加强。另外需要注意的是，本研究未筛选出任何通路与BzP相关，这可能与对BzP的毒性开展研究较少有关。在人体和环境尼泊金酯类调查研究中，BzP检出率和浓度相对其他尼泊金酯化合物均较低[6-10]。但最近，Valle-Sistac等[36]通过对志愿者胎盘中尼泊金酯类水平的调查，第一次发现BzP在胎盘中普遍存在。与其他尼泊金酯类不同，BzP不仅用作防腐剂，还广泛用作制药、印染/农药生产的中间体，这可能增加其暴露途径和水平。因此，今后应加强BzP毒性研究，为其生态和健康风险评估提供基础数据。

筛选出与生殖有关的通路(表4)主要包括两大类：一类与生殖相关激素的合成、分泌及活性有关，如甾类激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、卵巢类固醇生成(ovarian steroidogenesis)、催乳激素信号通路(prolactin signaling pathway)、促性腺激素释放激素信号通路(GnRH signaling pathway)、甲状腺激素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、催产素信号通路(oxytocin signaling pathway)；另一类则主要与卵巢发育有关，如母细胞减数分裂(oocyte meiosis)、孕酮介导的卵母细胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)通路。

在KEGG通路富集分析中，甾类激素生物合成通路、甲状腺激素信号通路以及催产素信号通路可能都还与脂代谢或肥胖有关。甾类激素生物合成通路不仅与类固醇激素前体有关，还涉及胆固醇生物合成[37]；甲状腺激素信号通路除了有助于维持垂体-性腺轴的稳定，影响生殖功能外，在能量代谢稳态中也起重要作用[38]；而催产素信号通路除了在分娩、哺乳等生殖相关过程中产生功能外，还通过LEP调控食欲和脂肪代谢[39]。另外，催产素信号通路还在中枢神经系统中发挥重要的调节功能，能够调节动物的亲社会行为(如孤独症)。因此，催产素信号通路可能介导了尼泊金酯类的多个相关毒性。

在与神经系统或功能相关的通路中，多个通路与化学突触有关，包括谷氨酸能突触(glutamatergic synapse)、GABA能突触(GABAergic synapse)、5-羟色胺能突触(serotonergic synapse)、胆碱能突触(cholinergic synapse)和多巴胺能神经突触(dopaminergic synapse)。因此，尼泊金酯类可能通过影响化学性神经突触，进而影响突触信号传递及神经系统的通讯功能。此外，神经活动配体-受体相互作用通路能够介导从细胞外环境到细胞的信号转导，调控突触的可塑性[40]。在逆向内源性大麻素神经信号转导通路中，内源性大麻素以活动依赖性方式从神经元释放，逆行作用于突触前CB1大麻素受体，并调节递质释放；这种逆行信号传导与短期和长期突触的可塑性有关，并且有助于某些形式的学习和记忆[41]。神经营养因子信号通路的功能包括促进神经元生长、发育和分化，保护受损神经元细胞免于死亡，促进神经元修复和再生，加强突触间信号转导[42]；还能够参与空间学习、认知功能和人格发展以及各种精神疾病的发病机制，包括情绪障碍、精神分裂症和孤独症等[34]。轴突导向通路在神经网络形成过程中起到非常重要作用[43]。笔者还筛选出2个与诱发神经性疾病相关的通路，分别是阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)通路和长期异型突触性抑郁(long-term depression)通路。

表4 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影响的有关KEGG通路Table 4 KEGG pathways affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

随着尼泊金酯类化合物使用规模和范围逐渐扩大，其作为新兴污染物对人类健康影响的研究亟需开展，以便对其进行更加全面的健康风险评估。由于其抗微生物作用，尼泊金酯化合物还可能干扰肠道共生微生物与人体构成的“超级共生体”，对人类健康产生间接影响。肠道共生微生物与人体的代谢、营养和免疫，甚至神经系统与精神健康等生理功能密切相关，是重要的“微生物器官”[44]。因此，尼泊金酯化合物对生殖、脂代谢以及神经系统的潜在影响，是否与其对肠道共生微生物与人体构成的共生体有关，应该在今后的研究中引起关注。