不同磷源对砷胁迫下2种绿藻生长的影响

陈敏怡，王振红,*，罗专溪

1. 闽南师范大学化学化工与环境学院，福建省现代分离分析科学与技术重点实验室，漳州 363000 2. 华侨大学环境工程系，厦门 361021

我国淡水资源匮乏，不少城市存在缺水问题。地表水作为工农业用水的重要水源，受工业化进程加速的影响，水体重金属污染和富营养问题日趋突出[1-2]。磷作为水生态系统限制性因子之一，主要以无机态的正磷酸盐和聚磷酸酯、磷脂、核酸、磷蛋白和磷酸糖类等有机磷形态存在[3-4]。近年来，通过政府管控，水体外源性磷供给减少[5]，由于内源性磷含量较高(水体沉积物总磷(TP)含量可达1 000 mg·kg-1)且较难清除与控制，使得其对水体富营养化的作用凸显[6]。有机磷作为沉积物中的主要磷成分[7]，其中，以易分解生物大分子为主的活性有机磷占比超50%，可被微藻等水生生物吸收利用[1,8]。

微藻能够利用自身的碱性磷酸酶对溶解性有机磷化合物(DOP)进行分解吸收[9]，并能将其转化为溶解性无机磷(DIP)(主要为正磷酸盐)重新释放到上覆水，在水体磷循环中扮演着重要的角色[10]。微藻在吸收利用DIP保证自身增殖的同时，对水生态系统中的磷也表现出明显的滞留功能[1]。研究表明，微藻对DOP的利用具有选择性，不同藻类对相同DOP的生长响应会产生明显差异[3-5]。Wang等[11]研究了5种导致水华的微藻对9种溶解性有机磷化合物的利用，结果表明，对DOP利用率高的藻种可以在群落结构中处于竞争优势，并进而成为水华优势藻种。

砷作为A类致癌物对人类以及动植物都有巨大的危害。砷在湖泊水体中主要以砷酸盐(As(Ⅴ))形态存在，与DIP相似的化学结构，使其可通过生物体的磷转运子进入细胞，同时受环境中DIP含量的调控[12-13]。刘金鑫等[14]的研究表明，铜绿微囊藻受砷和磷浓度的影响，磷酸盐浓度对藻体的砷代谢有一定的抑制作用。樊香绒等[15]研究发现，不同形态砷能对斜生栅藻的生长和其叶绿素荧光产生不同程度的抑制作用；且大多数藻类，如淡水藻(铜绿微囊藻[14]、蛋白核小球藻[16]和黑藻[17]等)以及海藻(盐生杜氏藻和三角褐指藻[18]等)都能利用有机磷进行生长，其对不同磷亦有不同的适应性，产生不同的生长趋势。目前，相关研究多集中在无机磷对微藻砷耐受性影响方面，较少涉及有机磷源时砷胁迫对藻生长的影响研究，尤其对不同磷源和不同微藻生长状况差异性不甚了解，这与当前水体所呈现出的内源性有机磷含量高且砷污染突出等严峻情势不相符，不利于对砷污染水体中水生态环境的全面了解。

斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是地球上早期生命体且存在至今，是淡水生态系统中的常见绿藻也是水华优势藻之一[19-20]。这2种绿藻具有对环境的较好适应性和强抗逆性，并具有高油脂与高蛋白含量等特性，这使它们不仅被用于水体重金属等污染物的去除，甚至被用于制备生物燃料和动物饲料[21]。绿藻不仅可作为环境毒理学的重要指示生物，而且也是水体环境质量监测与评价的重要指标[22]。因此，弄清淡水环境中这2种真核微藻对不同形态磷的适应性差异，及其在不同形态磷为主的水体中受As(Ⅴ)的胁迫效应将有助于更加全面深入地理解砷在淡水中的环境行为效应。为此本文选取与生物组织代谢密切相关且作为生命活动基本产物的β-甘油磷酸钠(β-P)和腺苷-5’-三磷酸二钠盐(ATP-P)为DOP源，生物培养中常规的磷酸氢二钾为DIP源，分析比较试验藻种(蛋白核小球藻和斜生栅藻)在3种磷源环境下的生长差异及受As(Ⅴ)的胁迫响应情况，为全面认识淡水环境砷污染效应、保障淡水生态健康和水质安全提供理论支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 藻的来源与培养

斜生栅藻和蛋白核小球藻购自中国科学院水生生物研究所国家淡水藻种库。于生化培养箱中，采用BG11培养基进行培养。腺苷-5’-三磷酸二钠盐购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度为98%；β-甘油磷酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度为95%；磷酸氢二钾购自西陇化工股份有限公司，为分析纯。分别单独配制3种磷储备液，同时以BG11培养液中的磷含量为准，配制以ATP-P、β-P和DIP为单独磷源的改性BG11培养液，由于有机磷的不稳定性，以上储备液均现用现配，并过0.22 μm无菌滤膜进行无菌处理。藻体接种及无菌改性BG11配制等试验操作均在超净工作台中进行。

1.2 藻的磷饥饿处理

取一定体积纯化的斜生栅藻和蛋白核小球藻藻液于4 ℃下，5 000 r·min-1离心10 min后，弃去上清液，用无菌超纯水同体积洗涤2次以尽可能降低藻液中残存的无机磷，之后移至灭菌的无磷BG11培养液中进行磷饥饿培养2 d[23]。所有容器均经体积分数为10%的HNO3浸泡后再经灭菌处理。

1.3 不同磷源环境下藻的生长

磷饥饿培养后的藻细胞经离心分离去除上清液后，再用无菌去离子水清洗2次，然后分别转移至DIP、β-P和ATP-P的不同磷源培养液中连续培养7 d，初始藻密度>1.0×106cells·mL-1，且分别设3个平行。于每天相同时间取样，分别测定培养液中的无机磷含量和藻体的细胞光密度与叶绿素荧光特性。

1.4 藻体受As(Ⅴ)的胁迫效应

取上述3种磷源下处于对数生长期的藻细胞(藻密度>1.0×106cells·mL-1)，分别接种于不同As(Ⅴ)环境(0～2.0×106μg·L-1，皆以砷元素计；砷酸盐购自国药集团化学试剂有限公司，为化学纯)中进行为期96 h的培养(每个处理均设3个平行)，每天相同时间取样，测定藻体的细胞光密度和叶绿素荧光特性。同时，采用以与对照组的比值所确定的各生长指标的比率作为终点，进一步估算不同磷源环境下As(Ⅴ)对2种试验藻的毒性效应。计算结果采用Sigma Plot 10 的S型剂量-响应曲线进行拟合[24]：

式中：e为各生长指标的生物响应，emin和emax分别为最小和最大的生物响应，cAs为培养液中As(Ⅴ)的添加浓度，EC50是50%抑制率对应的半数效应浓度。

1.5 指标测定

1.5.1 藻体细胞光密度测定

使用可见光分光光度计(MAPADA 722S型，上海美谱达仪器有限公司，中国)于680 nm波长处测定比色皿中的新鲜藻液的吸光度，即为藻体细胞光密度(OD)。同时，采用公式μ= ln(ct/c0)/t计算比生长率(μ)，式中：ct和c0分别代表时间t和初始时的OD；t为在As(Ⅴ)中的暴露时间。

1.5.2 DIP含量测定

取5 mL新鲜藻液，离心分离取上清液，经过0.45 μm膜过滤后用磷钼蓝法测其DIP含量，方法参照《海洋监测规范 第4部分 海水分析》(GB 17378.4—2007)[25]。

1.5.3 叶绿素荧光特性

取新鲜藻液约5 mL，暗适应5 min后，用高级浮游植物荧光分类仪(PHYTO-PAM，德国Walz公司)对所获取藻液的叶绿素a(Chla)和实际光合产率(Yield)进行测定。

1.6 数据分析处理

所有实验数据均进行单因素方差分析(ANOVA)和Pearson 相关分析(IBM SPSS Statistics 21)。图形采用Origin 2017和GraphPad Prism 7制作。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 不同磷源环境下2种藻的生长比较

不同磷源环境下由OD和Chla得出的斜生栅藻和蛋白核小球藻的比生长率如图1(a)所示。由图1可知，2个实验藻种均可以给定的3种磷作为唯一磷源进行增殖；由Chla得出的斜生栅藻的比生长率在3种磷源环境下差异显著，表现为β-P>ATP-P>DIP，而由OD得出的斜生栅藻的比生长率仅表现为β-P和ATP-P间的显著差异，且β-P中比生长率相对要高，说明斜生栅藻对β-P有更好的适应性，且以Chla的增殖表现更为明显。由OD得到的蛋白核小球藻的比生长率在3种磷源环境下无显著差异，而由Chla得出的蛋白核小球藻的比生长率表现为DIP较ATP-P和β-P相对要高且差异显著，说明蛋白核小球藻对DIP有更好的适应性。不同磷源对藻种间的增殖差异影响显著，该结果与Seok等[26]得出的2种鞭毛藻对DOP和DIP的利用率有显著差异的结果相一致，说明不同藻种对同一磷源适应性不同，斜生栅藻对β-P源的更好适应性可使其在该磷源下更有机会占据优势。

作为能反映藻细胞生理核心指标的Yield，一定程度上可较好地指示藻体的“生长潜能”，其主要与Chla、营养盐(特别是氮盐)比例和光照等有关。斜生栅藻和蛋白核小球藻在3种磷源下的7 d平均Yield值如图1(b)所示，斜生栅藻在不同磷源下的Yield无显著差异，但较蛋白核小球藻要高0.05±0.03。良好生理状态下藻类的Yield是一个稳定值，约为0.65[27]，可以看出，3种磷源下斜生栅藻的Yield均为良好生理状态的响应(0.64～0.65)，而蛋白核小球藻可能受其对营养盐(如氮磷)比例差异的影响致使其Yield相对要低，尤其在ATP-P环境下较其他2种磷相对要低，且差异性显著(P<0.05)，说明ATP-P在一定程度上阻碍了蛋白核小球藻的电子传递，使其Yield降低(约4.55%)。

图1 不同磷源环境下斜生栅藻和蛋白核小球藻细胞光密度(OD)和叶绿素a (Chl a)所得的比生长率(a)和实际光合产率(b)注：DIP表示溶解性无机磷(本研究选取磷酸氢二钾)，ATP-P表示β-甘油磷酸钠，β-P表示腺苷-5’-三磷酸二钠盐；不同字母表示不同处理间的差异显著，大、小写字母分别表示蛋白核小球藻、斜生栅藻的差异性，P<0.05。Fig. 1 Algal specific growth rate obtained from cell optical density (OD), chlorophyll a (Chl a) (a) and changes in algal quantum yield (Yield) (b) of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa under different phosphorus regimesNote: DIP stands for dissolved inorganic phosphorus (dipotassium hydrogenphosphate); ATP-P stands for adenosine triphosphate; β-P stands for β-sodium glycerophosphate; different letters represent significant differences in different treatments; the uppercase and lowercase letters represent the differences of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa, P<0.05.

由不同磷源下2种藻的Yield与Chla和OD的相关系数(表1)可知，DOP环境下斜生栅藻的Yield与Chla均显著负相关(P<0.05)，且β-P环境下的Yield与OD也显著负相关(P<0.05)，说明β-P在促进斜生栅藻Chla和OD增殖的同时会抑制藻体的Yield。斜生栅藻的Yield在DIP环境下与Chla呈显著正相关(P<0.05)，一定程度上可指示藻体在DIP环境下的生长潜能，但综合3种磷源环境可知，Yield在用来衡量斜生栅藻的营养状态时，并非稳定性指标。3种磷源环境下蛋白核小球藻的Yield与Chla和OD均非显著相关，这可能是由于产生光合作用的叶绿素天线复合体在光量子吸收过程中绝大部分被用来进行光化学反应，而荧光只占很小部分(0.6%～5%)，另外还有一部分为热耗散[27]。Yield作为反映藻体电子传递的实际量子产量，仅反映其光化学反应能量占吸收总光能的比例，因此，其未必与由高级浮游植物荧光分类仪所测定的Chla呈显著相关性。这与Mikacla和Kevin[28]得到的Yield不能作为测定浮游植物养分状态或生物量及增长率的可靠指标的结论相一致。

表1 不同磷源环境下藻体Chl a和OD与Yield的Pearson相关系数(n=21)Table 1 Pearson correlation between Yield and Chl a (or OD) of algae under different phosphorus regimes (n=21)

图2 不同磷源环境下介质中DIP含量的变化注：(a )斜生栅藻；(b)蛋白核小球藻。Fig. 2 Changes of DIP contents in culture media under different phosphorus regimesNote: (a) Scenedesmus obliquus; (b) Chlorella pyrenoidosa.

2.2 DIP变化

不同磷源环境下斜生栅藻和蛋白核小球藻介质中DIP含量变化如图2所示。DIP环境下2种藻培养7 d后，其介质中DIP含量均呈下降趋势，分别降低到初始DIP含量的59.8%和66.1%，2种藻对DIP的有效吸收利用无显著差异。β-P环境下斜生栅藻介质中DIP含量基本维持在(0.79±0.23) mg·L-1水平，而蛋白核小球藻则基本处于(2.00±0.16) mg·L-1水平，说明2种藻对介质中β-P向DIP转化的长期效应不明显，而蛋白核小球藻介质中β-P短期的较快转化原因尚不明确。ATP-P环境下斜生栅藻介质中DIP含量变化与DIP环境下一致，初始较高且呈下降趋势，7 d后介质中DIP含量降低到初始值的56.5%，而该磷源环境下蛋白核小球藻介质中DIP则呈上升趋势，上升到初始DIP含量的1.3倍，表明斜生栅藻能将ATP-P快速有效转化为DIP后对其进行吸收利用，而蛋白核小球藻对ATP-P转化相对较慢，且未表现出明显吸收效应。有研究表明，藻类对有机磷的利用有2种途径，一是对小分子有机磷进行直接吸收；二是通过碱性磷酸酶水解成正磷酸盐后再吸收利用[29]。斜生栅藻对ATP-P的吸收利用属于后者，由对β-P的利用及藻体的较好生长状况可知，其对β-P的吸收可能属于前者，具体有待于进一步研究证实。

由不同磷源环境下2种藻介质中DIP含量与藻体生长指标Chla、OD和Yield的相关分析(表2)可知，斜生栅藻在DIP环境下DIP含量与Chla显著负相关(P<0.01)，β-P环境下DIP含量与OD和Yield显著负相关(P<0.05)，该结果可进一步说明斜生栅藻对DIP和β-P的利用方式可能相同(直接吸收)，该藻通过对DIP的吸收促进藻体Chla的增殖，而β-P则促进藻体OD和Yield的增加。蛋白核小球藻介质中DIP含量与藻体Chla和OD显著负相关(P<0.01)，说明该藻对DIP的利用可同时促进藻体Chla和OD的增殖，蛋白核小球藻在2种DOP环境下介质中DIP含量与Chla和OD的显著正相关(P<0.05)则说明该藻对DOP的利用需要通过水解磷酸化有机磷为无机磷后再进行吸收利用进而促进藻体Chla和OD的增殖，与斜生栅藻对ATP-P的吸收利用类似(DIP与DO和Yield显著正相关)。相关研究表明，当光系统PSⅡ体系反应中心的电子受体受抑制时，叶绿素a荧光增强；当电子供体受到抑制时，叶绿素a荧光会降低[30-31]。正磷酸盐的缺乏会影响蛋白核小球藻PS Ⅱ中的电子受体与供体，该藻细胞可优先利用正磷酸盐合成ATP和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)以满足电子受体需求[32]。DOP环境下斜生栅藻介质中DIP与OD和Yield的显著正相关说明DOP在促进该藻细胞密度增殖和实际光能转化率方面有重要贡献，而对藻体Chla含量影响不大，说明斜生栅藻对DOP的利用与蛋白核小球藻明显不同。

表2 不同磷源环境下藻体Chl a、OD和Yield与DIP含量的Pearson相关系数 (n=21)Table 2 Pearson correlation between Chl a (or OD, Yield) of algae and DIP content under different phosphorus regimes (n=21)

2.3 As(Ⅴ)对藻的生长胁迫

3种不同磷源环境下As(Ⅴ)对斜生栅藻和蛋白核小球藻的96 h生长胁迫S型剂量-响应曲线分别如图3和图4所示。

图3 不同磷源环境下As(Ⅴ)对斜生栅藻96 h的生长胁迫及S型剂量-响应曲线拟合注：OD(of control)、Chl a(of control)和Yield(of control)是指用对照组样品进行标准化后的数值；曲线表示模型与S型剂量曲线的拟合。Fig. 3 The 96 h growth of S. obliquus impacted by As(Ⅴ) and their S-type dose-effect curves under different phosphorus regimesNote: OD (of control) , Chl a (of control) and Yield (of control) were normalized using the values determined for algae in non-spiked control samples; lines represent the model’s fits to sigmoidal dose-response curve.

图4 不同磷源环境下As(Ⅴ)对蛋白核小球藻96 h的生长胁迫及S型剂量-响应曲线拟合注：OD(of control) 、Chl a(of control)和Yield(of control)是指用对照组样品进行标准化后的数值；曲线表示模型与S型剂量曲线的拟合。Fig. 4 The 96 h growth of C. pyrenoidosa impacted by As(Ⅴ) and their S-type dose-effect curves under different phosphorus regimesNote: OD (of control) , Chl a (of control) and Yield (of control) were normalized using the values determined for algae in non-spiked control samples; lines represent the model’s fits to sigmoidal dose-response curve.

2.3.1 斜生栅藻

由OD、Chla和Yield这3个指标的方差分析得出在3种不同磷源环境下As(Ⅴ) 对 斜生栅藻的最低可观测效应浓度(LOEC)和无可观测效应浓度(NOEC)一致，分别为105μg·L-1和5×105μg·L-1，说明3种磷源环境下斜生栅藻对As(Ⅴ)的耐受性很高，且受磷形态影响不大。不同磷源环境下由OD、Chla和Yield拟合得到的As(Ⅴ)对斜生栅藻96 h-EC50及其相关系数(r2)如表3所示。除β-P环境下由OD指标得出的As(Ⅴ)的96 h-EC50相对较高外(高出约3个数量级)，不同磷源环境下的其余各指标得出的96 h-EC50均无显著差异，这说明β-P环境下斜生栅藻细胞密度受As(Ⅴ)的胁迫不敏感，但 OD指标在DIP和ATP-P环境下却表现出比Chla和Yield更高的敏感性，同时也进一步表明不同磷源环境会影响As(Ⅴ) 对斜生栅藻细胞增殖的胁迫效应。不同的是，Chla和Yield更能相对稳定地反映在不同磷源环境下As(Ⅴ)对该藻的胁迫效应。

表3 不同磷源环境下As(Ⅴ)对斜生栅藻各生长指标(OD、Chl a和Yield)的96 h半数效应浓度(96 h-EC50)Table 3 The 96 h median effect concentration (96 h-EC50) of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of S. obliquus under different phosphorus regimes

2.3.2 蛋白核小球藻

不同磷源环境下蛋白核小球藻受As(Ⅴ)胁迫时，由OD、Chla和Yield这3个指标方差分析得出的As(Ⅴ)对该藻的NOEC和LOEC如表4所示。DIP和ATP-P环境下OD是反映该藻As(Ⅴ)胁迫的一个敏感指标，而Chla是β-P环境下受As(Ⅴ)胁迫的敏感性指标。3种磷源环境下由OD、Chla和Yield所得出的As(Ⅴ)对该藻的96 h-EC50如表5所示，不同磷源环境下该藻对As(Ⅴ)的耐受性较好，且总体均表现为DIP>ATP-P>β-P，与不受As(Ⅴ)胁迫时该藻在不同磷源环境下的生长效应相一致；不同磷源环境下蛋白核小球藻受As(Ⅴ)胁迫时，Chla和Yield这2个指标有较好区分度；同时与NOEC和LOEC结果一致，96 h-EC50的结果显示，OD是DIP和ATP-P环境下As(Ⅴ)胁迫的敏感指标，而Chla是β-P环境下受As(Ⅴ)胁迫的敏感性指标。DIP环境下由OD得出的As(Ⅴ)对蛋白核小球藻的96 h-EC50较许荔萍等[32]的研究结果(150.7 mg·L-1)在数量级上一致但相对较高，可能与藻体培养环境或具体藻种差异等因素有关。与先前研究证实的As(Ⅴ)的胁迫受藻体对磷的摄取影响相一致[7,33]，蛋白核小球藻对As(Ⅴ)的胁迫响应受其在不同磷源环境下的适应性差异的影响显著。

表4 不同磷源环境下As(Ⅴ)对蛋白核小球藻各生长指标(OD、Chl a和Yield)的无可观测效应浓度(NOEC)和最低可观测效应浓度(LOEC)Table 4 The no observed effect concentration (NOCE) and lowest observed effect concentration (LOEC) of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of C. pyrenoidosa under different phosphorus environments

表5 不同磷源环境下As(Ⅴ)对蛋白核小球藻各生长指标(OD、Chl a和Yield)的96 h-EC50Table 5 The 96 h-EC50 of As(Ⅴ) obtained from OD, Chl a and Yield of C. pyrenoidosa under different phosphorus regimes

不同磷源环境下斜生栅藻和蛋白核小球藻受As(Ⅴ)胁迫时其Yield与Chla和OD的Pearson相关系数(双侧检验)如表6所示。由表6可知，受As(Ⅴ)胁迫下2种藻的Yield与Chla和OD均呈正相关关系，其中，斜生栅藻在不同磷源环境下的Pearson相关系数均表现出显著正相关(P<0.01)，蛋白核小球藻仅在DIP和ATP-P环境下，Yield与OD相关性不显著，其余也均显著相关(P<0.05)，这与在不受As(Ⅴ)胁迫时3种磷源环境下2种藻的生长效应间的相关关系(表1)表现出明显差异，说明在受外界As(Ⅴ)胁迫的情况下，Yield可以有效反映藻体对该胁迫的毒性效应。相关研究表明，砷胁迫会降低藻细胞的光化学量子效率，抑制其光合作用活性，并引起细胞叶绿体内层间空泡化、累囊体片层结构受挤压等[32]。藻体受As(Ⅴ)胁迫时，其Yield显著下降，胞内部分功能性PSⅡ光化学失活，吸收的光能以热耗散形式释放，藻细胞生长减缓甚至死亡，进而表现出Yield与OD和Chla的显著正相关。不同磷源环境下2种藻受As(Ⅴ)胁迫的96 h-EC50值表明，OD是反映斜生栅藻受As(Ⅴ)胁迫时的敏感性响应指标，而Yield是蛋白核小球藻的敏感性响应指标。

表6 受As(Ⅴ)胁迫时藻体Yield与Chl a和OD的Pearson相关系数Table 6 Pearson correlation between Yield and Chl a (or OD) of algae under As(Ⅴ) exposure with different phosphorus regimes

斜生栅藻和蛋白核小球藻在以DIP、ATP-P和β-P分别为唯一磷源时均能正常增殖，且不同磷源环境间以Chla的表现差异更为显著。不同磷源环境对不同藻种的生长影响表现不同；斜生栅藻对β-P的适应性更好，而蛋白核小球藻则在DIP环境下生长更好。2种藻对介质中β-P向DIP的转化效应不明显。斜生栅藻能将ATP-P快速有效转化为DIP后对其进行吸收利用，而蛋白核小球藻对ATP-P转化相对较慢，且无明显吸收效应。不同磷源环境下2种藻对As(Ⅴ)的胁迫响应有所不同，斜生栅藻对As(Ⅴ)的耐受性表现为β-P>DIP>ATP-P，而蛋白核小球藻则表现为DIP>ATP-P>β-P。同时，OD是斜生栅藻受As(Ⅴ)胁迫时的敏感性指标，而Yield是蛋白核小球藻的敏感性响应指标。As(Ⅴ)胁迫可以改变不同磷源环境下藻体Yield与Chla和OD的相关关系，使其由相对不稳定性生长指标转变为敏感性生长指标，从而可较好地响应As(Ⅴ)的胁迫效应。