贵州水族人群11个Y-SNP位点的多态性及法医学应用

（贵州医科大学法医学院，贵州 贵阳 550004）

人类Y染色体为男性特有的性染色体，其在减数分裂中不发生重组，以单倍体形式呈父系遗传[1]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，其突变率较STR低，具有较高的遗传稳定性[2]。Y染色体SNP（Y-SNP）单倍群谱系在世界人群中的分布具有很强的地理特异性，是研究人类父系迁移的理想遗传标记[3-5]。其中单倍群O、C、D、N约占东亚男性的93%[6]，O单倍群下游O1a-M199、O2a1-M95在中国南方集中分布，是南方壮侗语族人群的主要单倍型[7-8]。在法医学领域，Y-SNP单倍群可用于推断生物学检材的族群地域来源[9-10]，在陈旧性检材的身份鉴定中亦得到成功应用，如曹操叔祖父[11]、中国赴缅远征军[12]、淮海战役[13]等的遗骸鉴定。

水族是贵州省18个世居民族之一，主要聚居于黔桂交界的龙江、都柳江上游地带，贵州省黔南的三都水族自治县、荔波、独山、都匀等县市为其主要居住区。2003年何燕等[14]采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术研究，发现贵州三都水族的Y染色体单倍群主要为南方人群主要的单倍型O2a1-M95与O1a-M119，频率高达90%。本研究对贵州180份水族男性无关个体Y染色体上的11个Y-SNP位点进行分型检测，进一步分析其单倍群分布情况，探索其与其他民族的亲缘关系，以期为法医学族群地域推断应用和群体遗传学研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本收集和DNA提取

本研究使用的所有血痕滤纸片由贵州医科大学法医学院法医司法鉴定中心提供。收集来自贵州省荔波县、独山县、三都县、都匀市地区三代均为水族的无血缘关系男性样本180例，记录为贵州水族。在签署知情同意书的前提下，采集指尖血制成血痕滤纸片，自然阴干，常温保存。采用Chelex-100法[2]提取DNA，-20℃保存备用。本研究已通过贵州医科大学伦理委员会审查批准。

1.2 Y-SNP基因分型

单倍群O-M175、C-M130、D-M174和N-M231是东亚4个主要的Y染色体单倍群，其中O-M175是东亚最大的单倍群，约占75%[7-8]。依据2018版Y染色体谱系树（https://isogg.org/tree/2018/index18.html）和文献[15]调研，本研究选择了O-M175、C-M130、D-M174和N-M231位点及O单倍群下游的O1-F265、O2-M122、O1a-M119、O1b-M268、O2a-M324、O2b-F742、O2a2-IMS-JST021354共11个Y-SNP位点对贵州水族180份男性样本进行研究。

采用微测序技术对贵州水族男性样本11个YSNP位点的分型进行检测[16]，扩增引物及延伸引物见表1。使用9700型PCR仪（美国Applied Biosystems公司）进行PCR扩增，用3500遗传分析仪（美国Applied Biosystems公司）进行毛细管电泳检测。利用Gene-MapperTMID-X v1.4软件（美国Thermo Scientific公司）进行等位基因分型。

表1 11个Y-SNP位点的扩增引物和延伸引物信息Tab.1 Information of the amplification primers and extension primers for the 11 Y-SNP loci

续表1Continued Tab.1

1.3 数据分析

根据每个样本11个Y-SNP位点的分型判断其所属单倍群类别，用直接计数法统计180例贵州水族无关男性样本的Y-SNP单倍群频数及频率。基于所研究的贵州水族及文献[17-21]报道的22个民族群体的YSNP单倍群频率数据，采用统计软件包Multi-variate statistical package（MVSP）对包括研究目标在内的23个群体进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。采用Arlequin v3.5软件计算贵州水族与其他群体的Fst遗传距离，使用MEGA 4.0软件根据Fst值绘制系统发生树。

2 结 果

2.1 Y染色体单倍群在贵州水族的频率分布

11个Y-SNP位点所构成的单倍群谱系树如图1所示。180例贵州水族男性样本中，共观察到6种Y染色体单倍群：C-M130、D-M174、O1a-M199、O1b-M268、O2a-M324和 O2a2-IMS-JST021354。O 单倍群的分布频率最高，为71.11%，其次是C单倍群，为25.00%，之后是D单倍群，为3.89%，未观察到N-M231单倍群。其中分布频率较高的是O1b-M268、O2a2-IMS-JST021354、C-M130单倍群，分别为31.11%、28.33%、25.00%。分布频数和频率如表2所示。

图1 11个Y-SNP位点构成的单倍群谱系树Fig.1 Haplogroup pedigree tree of the 11 Y-SNP loci

表2 贵州水族单倍群频数及频率Tab.2 Numbers and frequencies of haplogroups in Guizhou Shui ethnic group

2.2 贵州水族与其他民族的比较

基于单倍群频率进行PCA，结果如图2所示。PC1和PC2的贡献率分别为41.90%和26.74%，两者的累计贡献率为68.64。从图2可以看出，除贵州毛南族与畲族外，其余民族的分布较为集中。本研究中贵州水族与贵州仡佬族和汉族的遗传距离较近，与贵州毛南族、畲族及羌族关系较远。从语系角度来看，除毛南族与布依族外，大部分壮侗语族（壮族、侗族、水族、仡佬族、仫佬族）距离较近；阿尔泰语系（蒙古族、满族）均在第二象限，距离也较近；汉语语族（汉族、回族）分布较为离散，不在同一象限；大部分的藏缅语族（纳西族、彝族、土家族、白族）距离较近，而景颇族及羌族距离较远；苗瑶语族除畲族外，瑶族与苗族均在第一象限，距离较近。

图2 贵州水族与其他22个民族的PCA图Fig.2 Principal component analysis of Guizhou Shui ethnic group and other 22 ethnic groups

贵州水族与其他22个民族的系统发生树如图3所示。系统发生树显示本研究对象贵州水族单为一类，与贵州同语族的仡佬族、侗族父系的亲缘关系最近。系统发生树中显示畲族与其他22个民族分为两支。按语言分类来看，各族群以小范围相同语系族群聚集在一起：壮侗语族中，仡佬族、水族、侗族亲缘关系较近，壮族、仫佬族、三都水族亲缘关系较为接近，而布依族及毛南族则与他们亲缘关系较远；藏缅语族的彝族、白族、纳西族亲缘关系最近，与土家族、羌族、景颇族亲缘关系较远；苗瑶语族的苗族与瑶族亲缘关系较近；阿尔泰语系的满族与蒙古族亲缘关系较远，同时汉语语族的汉族与回族亲缘关系也较远。PCA图与系统发生树结果相一致，均提示贵州水族与贵州仡佬族父系的遗传关系较近。

图3 贵州水族与其他22个民族的系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree of Guizhou Shui ethnic group and other 22 ethnic groups

3 讨 论

本研究对贵州水族男性无关个体11个Y-SNP位点进行分型，共观察到6种单倍群，频率最高的为OM175单倍群（71.11%），这与我国Y染色体单倍群的分布频率一致，约75%的中国人可归到这一类[5]。OM175是东亚人群的特征性单倍群，为O单倍群下游分支，O2-M122是汉藏族群的主要单倍群，而O1a-M119是壮侗语族群的高频率单倍群，O1b-M268和O2a2-IMS-JST021354 常见于 南 方少数民族[7-8，22]。2003 年 ，何燕等[14]对92例贵州三都水族Y染色体单倍群进行分析，主要单倍群为O2a1-M95（58.70%）和O1a-M119（31.50%），但是样本量较少，Y染色体单倍群数据存在一定的偏差。而在本研究中O1b-M268（31.11%）和 O2a2-IMS-JST021354（28.33%）均比 O1a-M119（10.56%）所占比例高，三者所占比例之和为70.00%，表明贵州水族是典型的南方少数民族。C-M130单倍群的频率为25.00%，相较于以往的文献报道存在一定差异。2003年，文波[23]检测的50例贵州三都水族人群中未观察到C-M130单倍群。2019年，张秀秀[17]在研究贵州17个世居少数民族人群时，也未检出C-M130单倍群。这可能与样本的采集地域和样本数量有关，同时也为贵州水族人群提供了新的参考数据。M130是C单倍群的特征位点，起源于第一批从非洲迁出的现代人类，在欧亚大陆的东部、东亚、东南亚地区人群可见，且C-M130下游的分支都有着区域特异性分布[24]，提示对贵州水族人群的族群来源或者对与之有基因交流的人群进行研究时，还应对C单倍群下游的分支进行分型。

对贵州水族与其他22个民族Y-SNP主要单倍群频率进行比较，可以看出，不同语系之间存在差异，除苗瑶语族的畲族以及汉语语族的贵州汉族、回族较为离散外，各语系以小范围的族群相互聚集在一起。而对于畲族及回族的语言归属存在过争议，根据其使用语言分别定为苗瑶语族及汉语语族[25-26]。从各语系聚类结果来看，聚类效果并不明显，这可能是由于所选择参考人群大部分为贵州族群，地理位置较为接近、各族群基因交流频繁所致。从PCA图可以初步看出，本研究的贵州水族与贵州仡佬族遗传距离最近。余跃生等[27]研究贵州水族线粒体DNA时发现，贵州水族与壮族存在较多的单倍型共享，与其具有同源性。本课题组前期对该贵州水族男性人群Y-STR进行研究时发现，贵州水族也与壮族遗传关系较近[28]，但是对贵州水族X-STR研究时发现，贵州水族与仡佬族、汉族亲缘关系较近[29]，本研究结果与其基本一致，这与样本量及采集样本的随机性有一定关系。水族与仡佬族均属壮侗语族，两者由古代“百越”族群发展而来[30]，这提示贵州水族可能是生活在中国西南地区的土著人口。本研究中贵州水族群体与张秀秀[17]研究的三都水族群体遗传距离较远，可以考虑对贵州地区各地域的水族样本更加细分、增加样本量来减少样本选择上所带来的误差。

本研究从Y-SNP单倍群角度，通过对180份贵州水族男性无关个体11个Y-SNP位点的检测与分析，获得单倍群频率数据，结果表明，贵州水族Y-SNP单倍群分布具有一定特异性，可为贵州地区法医学生物检材族群地域推断奠定基础，丰富贵州地区少数民族的遗传学基础数据。