双荧光素酶报告法验证乳腺癌中lncRNA PVT1 为let-7c-5p的靶基因

张硕 沈泳 高秀飞 谢小红

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码且以单链形式存在的RNA，通过互补配对至靶mRNA 的3′UTR，形成RNA 诱导沉默复合物，可以降解靶标mRNA 或者抑制mRNA 翻译。Let-7 是发现最早的一种miRNA，家族基因在多种癌症中扮演着抑癌基因的角色，如Let-7c-5p 能够负调控Myc、HMGA2 以及BclxL 等具有致癌作用的基因，抑制前列腺癌细胞的生长[1]、肺癌细胞的迁移和侵袭以及结肠癌的转移等[2-3]。Let-7c-5p 在乳腺癌患者血清中的表达水平明显低于正常人，在乳腺癌组织中，也呈低表达[4]。并且在雌激素受体-α（estrogen receptor-α，ER-α）呈阳性的乳腺癌患者中，表达水平相对较高的患者预后更好[5]，这意味着let-7c-5p在乳腺癌中很可能也是作为肿瘤抑制因子而存在。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度超过200 个核苷酸且不编码蛋白质的RNA，是基因调控网络中的重要组成部分，异常表达会扰乱基因调控网络导致中枢神经系统发育损伤或神经功能障碍[6]，还与许多疾病甚至肿瘤具有相关性[7]。浆细胞瘤转化迁移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于人类第8 号染色体上，已在多种癌症中被证实扮演癌基因的角色[8]。TCGA 数据库中近2500 例乳腺癌患者的基因芯片结果显示，22%的患者PVT1 呈现基因拷贝数扩增趋势，总生存率明显低于基因拷贝数未发生改变者，表明在乳腺癌的发生发展中起了重要的致癌作用[9-10]。竞争性内源RNA 学说认为lncRNA 上有miRNA 的结合位点，可以作为miRNA 的靶标来吸收miRNA，从而减弱miRNA 对靶mRNA 的抑制作用。本研究探索在乳腺癌中lncRNA 浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1）是否为let-7c-5p 的靶标基因，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 人乳腺癌细胞株MCF-7 购自于上海市中科院细胞库。E.coli DH5α 和反转录试剂盒均购自Takara 宝生物工程（大连）有限公司（批号：D9057、RR014A）；pRL-TK 载体质粒、pGL3 对照质粒以及双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega 公司（批号：E2241、E1751、E1910）；SanPrep 柱式DNA 割胶回收试剂盒购自美国Axygen 公司（批号：AP-GX-50）；细胞RNA 提取试剂盒DNA/RNA/Protein Isolation Kit 购自美国Omega Bio-tek 公司（批号：R6734-01）；胎牛血清购自美国Gibco 公司（批号：10100-147）；DMEM 高糖培养基购自杭州吉诺生物医药技术有限公司（批号：GNM12800）；细胞转染试剂购自美国Biomiga 公司（批号：GT1211-02）；let-7c-5p mimics 以及对照miR-NC mimics 于上海吉玛制药技术有限公司定制。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌中PVT1 表达水平检测 为明确PVT1 在乳腺癌中的作用，使用cBioPortal 数据库[9-10]对TCGA 数据库中收录的1097 例乳腺癌患者的1100 例标本中lncRNA PVT1 表达情况进行检测，发掘出PVT1 异常表达的患者数，进一步使用UALCAN 数据库[11]对患者癌变组织中PVT1 表达水平与正常组织中PVT1 的表达量进行比较。

1.2.2 生物信息学预测作用位点 利用RNAhybrid[12]和RegRNA[13]软件预测PVT1 序列上let-7c-5p 的结合位点，综合两个软件预测结果选取目的结合位点。

1.2.3 总RNA 的提取及目的产物扩增 MCF-7 细胞采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。收集生长状态良好的细胞，使用DNA/RNA/Protein Isolation Kit 试剂盒提取总RNA，提取步骤参照说明书。PVT1 原序列PVT1（Pw）扩增引物如下：上游引物5′-GCTCTAGAATCTTCAGTGGTCTGGGGAATAACG-3′，下游引物5′- ATAAGAATGCGGCCGCCTCTCTCCAAATCTCAGTGTC-3′，其中上游引物5′端增加XbaⅠ酶切位点及其保护碱基，下游引物5′端增加NotⅠ酶切位点及其保护碱基。采用重叠延伸PCR 敲除结合位点序列，从而扩增得到PVT1 突变序列（Pm）。结合位点上游序列Pm1 的上游引物与Pw 相同，下游引物5′- CACCTCGGGACCTAGCTGAGCG-3′；结合位点下游序列Pm2 的上游引物5′-GCTCAGATGGGTCCCGAGGTGCG-3′，下游引物与Pw 相同。以Pm1 和Pm2为混合模板扩增Pm，引物与Pw 引物一致。

取500ng 总RNA，以Pw 的下游引物为特异引物进行反转录生成cDNA，反应条件为42℃60min，70℃15min。取2μl cDNA 作为为模板，采用20μl 体系扩增Pm1、Pm2、Pm 和Pw。Pm1 和Pm2 扩增反应条件为95℃预变性3min；95℃30s，65℃30s，72℃20s，34 个循环，72℃5min；Pw 和Pm 扩增反应条件为95℃预变性3min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，34 个 循 环，72℃5min。

1.2.4 重组质粒的构建 对Pw、Pm 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶回收使用SanPrep 柱式DNA 割胶回收试剂盒。取割胶回收产物以及pRL-TK 载体质粒进行XbaⅠ和NotⅠ双酶切，将双酶切产物进行电泳并回收。目的片段与载体质粒摩尔比7∶1，16℃连接过夜，将连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α 中，涂布于含氨苄青霉素的LB 固体培养基，倒置培养12h，挑取单菌落进行摇床培养。12h 后收集菌体，提取质粒，进行XbaⅠ和NotⅠ双酶切验证，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5 细胞转染及检测 MCF-7 细胞培养同1.2.3。提取对照质粒pGL3、重组质粒pRL-TK-Pw 和pRL-TKPm。分为3 组进行转染，实验组：pGL3、pRL-TK-Pw、let-7c-5p mimics；对照组1：pGL3、pRL-TK-Pw、miR-NC mimics；对照组2：pGL3、pRL-TK-Pm、let-7c-5p mimics。每组共转染对照质粒40ng，重组质粒800ng，mimics终浓度为20nmol/L，每组设3 个复孔。48h 后裂解细胞，使用双荧光素酶检测试剂盒进行检测。化学发光仪测出各孔数据后减去空白孔的基底信号，以pGL3 质粒所发的萤火虫荧光信号为对照，重组质粒pRL-TK-Pw 以及pRL-TK-Pm 所发的海肾荧光信号除以萤火虫荧光信号为相对荧光活性，对各组数据进行归一化分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中PVT1 表达水平检测结果1097 例乳腺癌患者中，21%的患者检测出了PVT1 异常高表达，而这1097 例患者中PVT1 表达水平显著高于114 例对照组样本中的表达量（P＜0.001），见图1。

图1 乳腺癌患者中PVT1 表达情况（a：PVT1 在21%的乳腺癌患者中高度表达；b：乳腺癌和正常样本中PVT1 的表达）

2.2 结合位点预测结果RNAhybrid 软件预测显示PVT1 上614～636nt 为let-7c-5p 结合位点，见图2a；RegRNA 软件预测显示607～629nt 为结合位点，见图2b。综合两个软件预测结果，从原序列上敲除607～636nt 来构建突变序列。

图2 PVT1 序列上let-7c-5p 的潜在结合位点（a：RNAhybrid 预测的结合位点；b：RegRNA 预测的结合位点。）

2.3 目的产物PCR结果对Pm1、Pm2、Pm 和Pw 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3 所示。Pw 长度为493bp，Pm1 长度为310bp，Pm2 长度为174bp，Pm长度为463bp。对于条带不单一的产物，利用割胶回收的方法获得目的片段，再以此为模板进行二次PCR。

图3 PCR 产物电泳结果（a：Pw；b：Pm1；c：Pm2；d：Pm。M：DNA marker）

2.4 重组质粒构建结果对Pw、Pm 以及pRL-TK 载体质粒进行XbaⅠ和NotⅠ双酶切，再进行电泳并回收目的条带，pRL-TK 载体双酶切产物为4039bp，Pw 和Pm 双酶切产物分别为469bp 和439bp，见图4。连接后转化至感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素LB 固体培养基，12h 后挑取单菌落进行摇床培养。收集菌体，提取质粒进行双酶切验证及测序验证，验证结果表明结合位点序列敲除成功。双酶切验证结果见图5。

图4 pRL-TK 双酶切产物电泳结果（a：pRL-TK 载体双酶切电泳结果，M：1kb DNA ladder，1：pRL-TK 载体双酶切产物；b：Pw 和Pm 双酶切产物，M：DL500 DNA Marker，1：Pw 酶切产物；2：Pm 酶切产物）

图5 重组质粒双酶切验证结果（M1：DL500 DNA Marker；M2：1kb DNAladder；1、2：pRL-TK-Pm 酶切产物；3、4：pRL-TK-Pw 酶切产物）

2.5 双荧光素酶活性分析 分析结果显示，对照组1中转染对照基因miR-NC mimics 后，pRL-TK-Pw 的荧光活性正常，并未受到抑制；而实验组中转染let-7c-5p mimics 后，pRL-TK-Pw 的荧光活性受到了明显的抑制，降至对照组1 的62%（P=0.002），表明PVT1 原序列上存在let-7c-5p 的结合位点。对照组2 中共转染let-7c-5p mimics 和pRL-TK-Pm 后，pRL-TK-Pm 的活性未受到抑制，表明结合位点被成功敲除，也进一步说明PVT1为let-7c-5p 的靶基因，见图6。

图6 双荧光素酶活性分析（注：与对照组1 比较，**P＜0.01）

3 讨论

2011 年Salmena 等[14]提出竞争性内源RNA 假说，表明lncRNA 上存在miRNA 结合位点，可以与mRNA竞争miRNA，从而形成一个大规模的调控网络，而该调控网络存在一定稳定性，稳定性被破坏则会引起疾病甚至肿瘤的发生。近年来，大量研究证实了竞争性内源RNA 的调控机制，如癌基因lncRNA H19 在结直肠癌中过度表达能够促进结直肠上皮细胞间质转化，使上皮细胞转化为具有活动能力的间质细胞，并获得侵袭和迁移能力，进一步研究发现H19 可以通过其序列中的miRNA 结合位点来结合miR-200a，从而减弱miR-200a 对其靶基因E 盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1）和ZEB2 的抑制作用，而ZEB1 和ZEB2 是上皮细胞间质转化相关因子，可见H19 可以以竞争性内源RNA 形式发挥致癌作用[15]。竞争性内源RNA 的提出更加全面地阐明了疾病或者癌症发生发展过程中基因间的相互作用，也证明非编码RNA 的存在并不是无意义的，它们可以通过多种方式影响mRNA的表达或翻译，从而调控生物学行为。

研究表明，lncRNA PVT1 具有致癌作用，其在胃癌组织中的表达量显著高于对应的癌旁组织，其高表达与患者的肿瘤侵袭与转移情况呈正相关，PVT1 的高表达常常意味着较差的预后，在胃癌细胞中干扰其表达能够有效地抑制胃癌细胞增殖并且能够诱导细胞凋亡[16]。Zhang 等[17]还发现，PVT1 在胃癌中高表达会导致顺铂耐药的产生，明显干扰治疗效果。在非小细胞肺癌中也发现PVT1 表达呈上调趋势，且其表达与组织学分级和淋巴结转移紧密相关，在非小细胞肺癌细胞中干扰PVT1的表达，则细胞增殖、侵袭以及迁移能力均受到抑制[18]。另外，PVT1 高表达的胰腺癌患者具有更短的总生存期[19]。Ergun 等[20]研究还证实，PVT1 可以通过抑制细胞正常凋亡来促进乳腺癌的发生。在本研究中通过cBio-Portal 和UALCAN 数据库探索大量乳腺癌样本中PVT1的表达情况，发现超过20%的乳腺癌患者中PVT1 呈异常高表达，且乳腺癌组织中PVT1 的表达量明显高于对照的正常组织，意味着在乳腺癌中PVT1 很可能也扮演着致癌基因的角色，且其具有成为乳腺癌诊断的生物标志物的潜力。

既往研究表明，抑癌基因let-7 家族成员let-7c-5p在乳腺癌患者血清和乳腺癌组织中的表达量均低于正常对照样本中，且提高let-7c-5p 的表达量会抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，表明let-7c-5p 在乳腺癌中具有抑癌作用[4，21]。结合竞争性内源RNA 假说，笔者推测致癌基因PVT1 可能为let-7c-5p 的靶标基因，通过软件预测出PVT1 序列上let-7c-5p 的结合位点，并应用双荧光素酶报告系统对其进行了验证，结果显示let-7c-5p 能够抑制含PVT1 原序列的荧光素酶载体活性，但对含PVT1 突变序列的荧光素酶载体活性则无抑制作用，该结果证实了PVT1 为let-7c-5p 的靶标基因。笔者由此推论出PVT1 可以与let-7c-5p 的靶mRNA 竞争，从而保护靶mRNA 免受降解或抑制，所以PVT1 的高表达能够造成let-7c-5p 抑癌能力的下降，该研究结果表明在乳腺癌中lncRNA PVT1 可以以竞争性内源RNA 的角色发挥作用。

本实验中采用了最典型的MCF-7 细胞作为模式细胞进行研究，进一步研究还需要在更多乳腺癌细胞中对该机制进行验证。此外，每个lncRNA 都能够结合多个miRNA，每个miRNA 也能被多个lncRNA 结合，本研究只是探究了其中的一小部分，乳腺癌发生发展过程中相关基因间的相互作用机制仍然需要被继续深入探索，才能为乳腺癌的早期诊断、靶点治疗、基因治疗以及更好的预后等提供更加有力的基础依据。