何首乌中磷脂的成分分析

李 燕，郭东贵，田黔粤，李立鹏

(贵州理工学院，贵州 贵阳 550003)

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根[1]，何首乌中主要成分为二苯乙烯苷类、蒽醌类、核苷类、黄酮类、无机元素和磷脂类[2-6]。磷脂酰胆碱，又称卵磷脂，是组成细胞膜最丰富的磷脂之一。卵磷脂在人体组织器官中，以脑、骨髓和神经组织中含量最多。卵磷脂中的胆碱对脂肪有亲和力，能促进脂肪的代谢，因此卵磷脂还可降低血清胆固醇含量，具有抗脂肪肝的作用，另外，对肝细胞膜具有修复作用[7]。

卵磷脂有利于神经发育和增强记忆功能。磷脂酰胆碱在体内水解成胆碱后与大脑中的乙酸结合形成乙酰胆碱，乙酰胆碱是神经系统信息传递时必需的化合物，其含量越高，脑神经细胞间的信息传递越快，记忆功能会得到增强[8]。随着年龄增长乙酰胆碱含量会有所下降，补充卵磷脂，可以减缓记忆力衰退的进程，预防或推迟老年痴呆症的发生。婴幼儿补充磷脂有利于神经发育和认知能力的提高[9-10]。此外，卵磷脂还可以增强胰脏机能，促进胰岛素的分泌，能分解油脂，清除过氧化物，降低血液中的胆固醇和脂肪，具有调节血脂、防治糖尿病和动脉硬化等保健功能[11-14]。目前，卵磷脂已较多添加于各类保健品和功能性食品中。

贵州省大力发展中药材的标准化种植，有天麻、杜仲、石斛、何首乌、太子参、白芨等，而目前2015年版《中国药典》中只有二苯乙烯苷和蒽醌的含量测定方法，何首乌的卵磷脂含量测定方法没有记载，并且有关卵磷脂含量测定的报道比较少。目前有报道采用分光光度法、薄层色谱法和超临界流体萃取-高效液相色谱法测定卵磷脂的含量，但方法较繁琐，难以满足现代科技发展和物质水平对质量检测的要求。本试验采用高效液相-蒸发光散色检测器，对贵州不同产地的何首乌药材的卵磷脂成分进行分析，并建立了卵磷脂的测定方法，为贵州何首乌药材的质量标准提升、标准化种植、以及后期相关功能性食品和保健品的开发和利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪，蒸发光散色检测器(Alltech ELSD 2000ES)，FA2004分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)，SF8200HPT型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)，F1AA29498型纯水仪(艾威仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇(A.R，天津市富宁精细化工有限公司)、三氯甲烷(A.R，重庆京东化工有限公司化学试剂厂)、三乙胺(色谱纯，Tedia公司)、异丙醇(色谱纯，SK Chemicals Uisan公司)、正己烷(色谱纯，Honewell Burdicke Jackion公司)，磷脂酰胆碱对照品(又名：卵磷脂)(批号：P3556)购于美国sigma公司，何首乌药材样品来源见表 1，经贵州大学熊源新教授鉴定均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的块根。

表1 何首乌药材的来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent SIL柱(5μm，4.6×250mm)；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.45∶0.05)为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A(20∶48∶32)为流动相B，梯度洗脱，柱温40℃；流速1mL/min；进样量10μL，记录时间20min，漂移管温度为90℃；载气流量为2.8L/min。梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液的制备

取磷脂酰胆碱0.0024g，置10mL的容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(2∶1)溶解并稀释至刻度，配置成240μg/mL的溶液。

2.3 提取条件的考察

2.3.1 提取溶剂的考察

精密称取何首乌粉末(过五号筛)24份，每份0.2g，分成4组，置250mL具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、氯仿、乙酸乙酯和Folch试剂(氯仿∶甲醇为2∶1) 25mL，密塞，称重，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。所得供试品溶液照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算磷脂的含量见表3。

表3 不同溶剂卵磷脂含量

由结果可知，用Folch试剂作为溶剂提取的峰面积最大，故选择Folch试剂为提取溶剂。

2.3.2 提取时间的考察

精密称取同一批何首乌粉末(过五号筛)18份，每份0.2g，分成3组，置250mL具塞三角瓶中，分别精密如入Folch试剂25mL，密塞，称重，按组分别于冷水中超声30，60，90min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。所得供试品溶液照"2.1"项下色谱条件进行测定，计算磷脂的含量见表4。

表4 不同提取时间卵磷脂含量

结果表明60min和90min的含量相差不大，考虑卵磷脂超声时间过长，水温易热，使卵磷脂降解，最后选择超声提取60min作为提取时间。

2.3.3 提取用量的考察

精密称取同一批何首乌粉末(过五号筛)18份，每份0.2g，分成3组，置250mL具塞三角瓶中，分别精密如入Folch试剂25，50，75mL，密塞，称重，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。所得供试品溶液照"2.1"项下色谱条件进行测定，计算磷脂的含量见表5。

表5 不同提取用量卵磷脂含量

由结果可知， 提取溶剂量为25mL卵磷脂含量最高，因此提取溶剂用量选25mL。

2.3.4 供试品溶液的制备

药材样品低温干燥后粉碎(过五号筛)，精密称取粉末0.5g，置250mL锥形瓶中，精密加入Folch试剂25mL，密塞，称定重量，于冷水中超声提取60min，取出称重并补重，静置后取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察

分别吸取上述对照品溶液2，4，6，8，10μL，照“2.1”项下色谱条件进行测定，以浓度C的对数值为横坐标，峰面积A的对数值为纵坐标计算回归方程，回归方程为lgA=1.12lgC+4.66，r=0.9974。表明卵磷脂在48 ～240μg/mL之间呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验

精密吸取磷脂酰胆碱标准溶液(240μg/mL)10μL，照“2.1”色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值，如表6。

表6 精密度试验结果

2.4.3 重复性试验

精密取第四批施秉何首乌药材样品6份,分别按“2.3”项下方法进行制备，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各份样品的含量，并计算RSD%，如表7。

表7 重复性试验结果

2.4.4 稳定性试验

取第四批施秉何首乌药材的样品溶液，分别在0、1、2 、3 、 4h内进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定。记录峰面积，计算RSD值，如表8。

表8 稳定性试验结果

2.4.5 加样回收率试验

取已知卵磷脂含量的何首乌粉末0.1g，过五号筛，平行取6份，精密称定重量，置250mL具塞锥形瓶中，分别加入对照品，分别按“2.3”项下方法进行制备，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率和RSD%，结果见表9。

表9 加样回收率试验结果

2.5 含量测定

称取16批何首乌粉末(过五号筛)，每批何首乌平行称量3份，每份约0.2g，照“2.3.4”项下的方法制备，照“2.1”项的色谱条件进行测定，计算各供试品卵磷脂的含量，结果见表10。

表10 16批何首乌药材卵磷脂含量(验次数n=3)

备注：1-都匀，2-都匀，3-贵阳，4-施秉，5-德江，6-印江，7-湄潭，8-凤岗，9-赫章，10-六枝，11-水城，12-安龙，13-兴义，14-兴仁，15-关岭，16-宁谷。

3 讨论

本研究运用高效液相色谱仪-蒸发光散色检测器测定了贵州省各产地何首乌中卵磷脂的含量，所选药材覆盖整个贵州省，具有一定的代表性。本研究通过对供试品溶液制备方法在提取溶剂、提取时间和提取用量方面进行了考察，结果表明，采用超声提取方法，加Folch试剂25mL，提取60min，能够达到良好的测定效果，经方法学考察平均回收率达到100.01%。经方法学考察，该方法稳定可靠，与文献报道的采用分光光度法、薄层色谱法和超临界流体萃取-高效液相色谱法测定卵磷脂含量的方法相比，此方法简便且精密度高，满足现代中药材对质量检测的要求。由于卵磷脂具有较高的药用价值，该方法可增加到何首乌的质量检测指标中，为贵州何首乌药材的质量标准提升、质量控制 、标准化种植以及后期产品的开发和利用提供科学依据。