FAP和MMP-9在人乙肝相关性肝纤维化分级及肝癌中的表达意义

马海芬 肖维华 虞继红 余波 蒋茂芬

肝星状细胞（HSC）是肝纤维化发生的关键细胞，在肝纤维化过程中对细胞外基质（ECM）的生成与降解均有重要的意义。肝内参与ECM 降解主要是基质金属蛋白酶类（MMPs）。MMPs 是被广泛认为对基质重塑起重要作用的一种I 型胶原酶，在肝纤维化发生机制的研究中具有重要意义，在癌细胞侵袭转移过程中具有重要的地位。成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是一种间质细胞产生的跨膜丝氨酸蛋白酶，在组织重塑中发挥重要的作用，现在已经成为一个激活的成纤维细胞的特异性标记物，对肿瘤的浸润、转移有重要意义。目前国内对FAP 和MMPs 与纤维化的研究多集中在动物实验及体外培养方面［1］。在人体内肝纤维化和肝癌组织中的表达意义尚未见报道。本研究拟检测乙肝相关性肝纤维化和肝癌组织中FAP 和MMP-9 的表达水平，为肝纤维化的预防和治疗提供理论基础，并为临床早期诊断肝癌的发生与发展提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集近3 年本院病理证实肝纤维化的肝穿刺标本42 例和肝癌手术切除标本32 例，共74 例入组，血清乙肝表面抗原阳性，除外合并HCV、HDV、HIV 等病毒感染，除外自身免疫性肝病、药物性肝炎等其它可能导致肝实质病变的慢性疾病。肝硬化组织取自距肿瘤边缘＞1cm。同时收集非乙肝相关性肝病组织11 例（包括5 例脂肪性肝病、2 例自身免疫性肝病和3 例原因不明的肝功能异常）和因外伤切除的临床和病理证实为正常肝组织的病例13 例作为对照。乙肝相关性肝病患者包括男51 例，女23 例；年龄25～82 岁，中位年龄49.5 岁。炎症分级和纤维化分期结合HE 和Masson 染色结果，按简化的慢性肝炎的评分系统，S0：无纤维化；S1：汇管区扩大，轻度纤维化；S2：汇管区周围纤维化或纤维分隔形成，但小叶结构保留；S3：纤维化伴小叶结构紊乱，但无明显的肝硬化；S4：可能或肯定的肝硬化。74 例患者中S1=18，S2=23，S3=10，S4=23。所有肝癌病例均有详细的临床资料、手术记录。术前未行任何抗肿瘤治疗。肿瘤直径＞3cm 者14 例，≤3cm 者18 例；组织学分级显示高中分化20 例，低分化12 例；伴肝硬化20 例，无肝硬化12 例。实验中23 例S4 期标本包括穿刺组织3 例和肝癌周围肝硬化组织20 例。所有标本经2 名病理主治医师复习。收集的临床数据包括术前血清AFP、术前血清HBV-DNA、肿瘤大小、肿瘤数目、分化程度、脉管癌栓等数据。

1.2 主要试剂 Fibroblast activation protein（Abcam，ab207178）兔单克隆抗体（稀释度为1：200）购自艾博抗（上海）贸易有限公司、MMP-9（56-2A4）鼠单克隆抗体（稀释度为1：100）购自福州迈新生物技术有限公司；鼠兔通用型二抗PV6000 免疫组化试剂盒（Dako，K5007）购自Dako 公司。

1.3 方法 采用免疫组化PV-6000 二步法。活检组织经石蜡包埋切片，石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后行免疫组化染色，抗原采用枸橼酸缓冲液高压锅高温高压修复，余步骤严格按照试剂盒说明书进行。用免疫组化方法检测组织中FAP 和MMP-9 的表达水平。阳性对照选用已知阳性片，阴性对照选用因外伤切除的正常组织，并用TBS 代替一抗作阴性试剂对照。

1.4 阳性结果判断 肝纤维化组织中FAP 的阳性表达主要分布于门管区内血管壁周围及小叶周围纤维间隔内的成纤维细胞的胞浆中，MMP-9 的阳性表达也分布于成纤维细胞的胞浆中，与FAP 表达重叠的区域在门管区及纤维间隔中。肝癌组织中FAP 的阳性表达分布于枯否细胞、间质成纤维细胞的胞浆中，MMP-9 的阳性表达主要分布于癌细胞的胞浆中，间质细胞中有少量表达。FAP、MMP-9 染色阳性物质呈黄色、棕黄色细颗粒状。免疫组织化学结果判定被相对量化为阳性染色间质面积和切片中选择的整个间质区域的百分比：强阳性，＞30%间质细胞中等到强染色；弱阳性，5%～30%间质细胞中等到强染色或＞30%弱染色；阴性，＜5%间质细胞染色弱或未着色。强阳性染色结果定义为高表达，弱阳性和阴性染色结果定义为低表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。采用χ2检验和Fisher 确切概率法，观察FAP 和MMP-9 两指标在肝纤维化S1-S4 期和肝癌组织中的表达。FAP 和MMP-9 蛋白的相关性分析采用Spearman 等级相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAP 和MMP-9 在肝纤维化不同分期的表达 见表1 和图1。

表l FAP和MMP-9在人乙肝相关性肝纤维化分期的表达（n）

图1 不同分期肝纤维化组织中FAP和MMP-9的表达（PV-6000二步法×200）。A-C：随着肝纤维化1-3期进展，FAP表达有增强趋势。D：纤维化4期FAP表达明显减弱。E-G：随着肝纤维化1-3期进展，MMP-9表达有增强趋势。H：纤维化4期MMP-9表达明显减弱。

2.2 FAP 和MMP-9 在肝癌组织中的表达 32 例肝癌组织中均可见FAP 和MMP-9 的表达，分布于枯否细胞、肿瘤细胞团周围及侵袭前沿的邻近间质。肝癌组织中FAP 和MMP-9 高表达率分别为50%（16/32），43.8%（14/32）。而肝硬化组织中FAP 和MMP-9 基本上弱表达或不表达，其高表达率仅为3.1%（1/32），6.3%（2/32）。FAP 和MMP-9 在肝癌组织中的表达显著高于肝硬化组织（P=0.000）。

2.3 FAP 和MMP-9 在非乙肝相关性肝病和正常肝组织中的免疫组化结果 对照组中11 例非乙肝相关性肝病的FAP和MMP-9高表达率分别为54.5%（6/11），9.1%（1/11）。正常肝组织的FAP 和MMP-9 表达均呈阴性。

2.4 FAP 和MMP-9 表达与肝癌临床病理特征的关系 FAP 的高表达与肝癌患者的术前血清AFP、肿瘤数目、分化程度有关（P＜0.05），而与术前血清HBVDNA、肿瘤大小、脉管癌栓和周围肝硬化无关（P＞0.05）。

2.5 FAP 和MMP-9 表达的相关性 Spearman 相关性分析显示在人乙肝相关性肝纤维化和肝癌组织中FAP和MMP-9 的表达呈正相关，其中S2 和S4 期中呈显著正相关（P＜0.05）。Spearman 相关性分析显示在肝癌组织中FAP 和MMP-9 的表达有相关性，两者成正相关（P＜0.05）。

3 讨论

本研究发现人乙肝肝纤维化不同分期中FAP 和MMP-9 表达强度也有一定规律。正常肝组织FAP 和MMP-9 表达呈阴性，肝纤维化期FAP 和MMP-9 有不同程度阳性表达，随着肝纤维化程度的增加FAP 和MMP-9 表达均有增强趋势。另外，本实验观察到在纤维化4 期及肝硬化阶段FAP 和MMP-9 表达均明显减弱，与近癌周肝纤维化组织的FAP 和MMP-9 有较强的阳性表达形成了鲜明的对比。

同时作者发现在不同分期中MMP-9 的表达强度和范围弱于FAP。考虑这可能与MMPs 随着纤维化的进展，被金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）抑制有关。因为早有研究报道，TIMP 是MMP 的特异性抑制因子，以1：1 的比例形成MMP-TIMP 复合物，从而阻止MMP9 与底物结合，抑制其降解活性，在肿瘤的侵袭转移中起负性调节作用［2］。

最近有作者通过克罗恩病黏膜的研究，观察了纤维化组织中FAP、MMPs 及TIMP 的表达，发现狭窄型黏膜肌成纤维细胞FAP 表达上调，抗FAP 抗体治疗狭窄组织时，胶原蛋白产生剂量依赖性下降，尤其是对I 型胶原蛋白的影响。治疗还能减少克罗恩病狭窄时的TIMP-1 的产生，而不会改变MMP-3 和MMP-12 的分泌。提示了FAP、MMPs 及TIMP 在纤维化中导致平衡改变的作用［3］。

近年来，随着肿瘤上皮-间质转化的研究不断深入，人们发现FAP 还表达于间叶组织来源的恶性肿瘤细胞中和上皮源性恶性肿瘤的成纤维细胞（TAFs）中，几乎不表达于正常组织及良性上皮肿瘤间质中静息成纤维细胞，且罕见于上皮性肿瘤细胞。Sukowati 等在人肝癌细胞株HuH-7 和JHH-6 培养中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）上调了TGFB1、FAP 的基因表达，提示CAF 作为间质干细胞，在肝癌发生和转移过程中与肝癌细胞相互转换的依据［4］。

在人肝癌的研究中，张等［5］采用PCR 方法检测了33 例肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织、远隔相对正常肝组织以及13 例对照组的FAP mRNA 结果，均为阳性，但肝癌组织FAP mRNA 表达明显高于癌旁及其余肝组织。另外，FAP mRNA 随着肝癌临床病程的进展以及分化程度的下降表达增多。本实验采用免疫组化方法检测蛋白表达，结果显示肝癌组织中均可见FAP 和MMP-9 的表达，且显著高于周围肝组织。FAP的高表达与肝癌患者的术前血清AFP、肿瘤数目、分化程度有关。

综合以上研究结合文献，推测乙肝肝纤维化不同分期中FAP 和MMP-9 的作用机制。肝损伤早期，位于肝窦周围的HSCs 增殖并激活，FAP 和MMPs 都被诱导表达。活化的HSCs 分泌多种因子，趋化HSC 向肝损伤部位迁移和增殖。因此，FAP 和MMPs 随着纤维化发展表达增强，中期达到高峰。在肝纤维化后期包括肝硬化组织，IL-10 通过下调炎症反应并增加组织间隙胶原酶的活性，使HSC 趋于静止状态，FAP 表达明显减弱。因为MMPs 能被金属蛋白酶组织抑制物抑制，所以表达比FAP 更弱。伴随肝癌的发生，肝实质内固有的HSCs 被激活，活化HSCs 数量增多，所以近癌周肝纤维化组织有明显的FAP 和MMPs 阳性表达。

两者与肝癌发展的关系，目前尚不明确。有研究发现肝癌组织中HSC 的数量较正常肝组织明显增多，且随HCC 进展，其数量逐渐增多。HSC 可能通过分泌FAP 间接促进肝癌的发生与转移。动物实验发现敲除FAP 基因可以间接抑制肿瘤生长［6］。Huang 等［7］在乳腺癌体外研究发现，表达野生型FAP 或FAP（S624A）的细胞能更广泛地降解细胞外基质（ECM），积累更高水平的MMP-9，更易侵袭I 型胶原。因此得出结论：FAP 的蛋白水解活性参与基质降解，但蛋白的其他功能促进肿瘤的增长。另有研究发现在肝硬化和肝癌组织中，实质-间质界面附近的肝细胞中神经肽Y 及其受体Y2R 增加，有机会与附近活化的间充质细胞中的FAP 相互作用。新发现提示了FAP 的底物特异性，揭示了FAP 在肝脏神经肽调节和癌症生物学中的潜在功能。

综上所述，FAP 和MMP-9 可能协同促进肝星状细胞的活化，参与降解细胞外基质，从而促进肝纤维化和肝癌的发生发展。因此通过对FAP 和MMPs 的进一步研究，有望以HSCs 为靶标，为治疗人乙肝相关肝纤维化和早期阻止肝癌侵袭转移提供新的理论依据。