Hcy及其代谢酶基因多态性与急性腔隙性脑梗死的相关性研究

邱玲玲 陈慧 徐小辉 赵江

腔隙性脑梗死（lacunar infarction，LI）是由大脑半球或脑干深部的小的穿通动脉闭塞引起，病灶直径通常＜1.5cm，是常见的缺血性脑血管疾病，约占脑梗死的20%～30%。目前腔隙性脑梗死的发病机制尚未完全明确，普遍认为该疾病是基因遗传与环境因素（如高同型半胱氨酸血症、高血压等）共同作用的复杂性疾病。高同型半胱氨酸血症（hyperhomocystinemia，HHcy）是脑血管疾病的独立危险因素［1］，血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平受遗传及环境因素（如低叶酸、低维生素B12）影响，其中基因易感性是影响Hcy 代谢的重要因素，亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 是Hcy代谢过程中的关键酶，当其677 位点上等位基因C 突变为T 时，使编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，导致MTHFR 酶活性下降，使Hcy 水平升高［2］。由此可推测MTHFR C677T 基因有可能是腔隙性脑梗死的候选基因。本研究采用病例对照的研究方法，以台州地区人群为研究对象，运用PCR 及TaqMan 探针技术对MTHFR C677T 进行基因分型检测，明确该基因位点多态性与急性腔隙性脑梗死的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月至2018 年6 月本院神经内科住院患者及同期体检中心体检人员共278 例。急性腔隙性脑梗死146 例（观察组），其中男87 例，女59 例；平均年龄（63.21±9.97）岁。均符合各类脑血管疾病诊断要点［3］中的腔隙性脑梗死诊断标准，并经头颅MRI 的DWI 序列证实。排除脑卒中史、侧脑室旁多发缺血病灶、脑白质病变、无症状性脑梗死、脑出血、颅内占位性病变；排除患有严重心功能不全、严重肝肾功能障碍、血液病、呼吸衰竭、恶性肿瘤、免疫系统疾病等患者；排除妊娠、心脏瓣膜病、心房颤动等。正常对照组为本院同期体检中心健康体检人员共132 例，其中男66 例，女66 例；平均（61.17±9.97）岁。无脑血管意外病史者，经头颅MRI 检查证实显示正常，所有受试者近3 个月均未服用过叶酸、维生素B6、维生素B12，两组间的年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经台州市立医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.2 研究方法 （1）基本资料收集及相关诊断标准：所有符合对象于入院时记录年龄、族别、性别、吸烟史、饮酒史、高血压病史、糖尿病史、卒中史、冠心病史、家族史及久居地等，测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、空腹血糖（FBS）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、Hcy、叶酸等指标。本研究中相关诊断标准如下，饮酒史：≥3 次/周，平均饮白酒≥50ml/次，持续＞1年。吸烟史：几乎每日吸烟，平均≥1 支/d，持续＞1年。高血压：收缩压≥140mmHg（1mmHg=O.133kPa）和（或）舒张压≥90mmHg 或有高血压病史并服用降压药者［4］。以Hcy 水平＞15μmol/L 定义为HHcy。冠心病包括有客观证据（如心电图、动态心电图或冠状动脉造影）的心肌缺血、稳定性心绞痛、急性冠脉综合征、陈旧性心肌梗死、冠状动脉旁路移植术（CABG）及冠状动脉介入治疗术（PCI）后患者。糖尿病：按照1999 年WHO 糖尿病的标准，空腹血糖≥7.0mmol/L、随机血糖≥11.1mmol/L、糖耐量试验2h 血糖≥11.1mmol/L 或有糖尿病病史并服用降糖药者。血脂异常：TC ≥6.2mmol/L，HDL-C＜1.0mmol/L，LDL-C ≥4.1mmol/L，TG ≥2.3mmol/L［5］。（2）标 本采集及DNA 提取：受试者禁食12～14h，采取肘静脉血送本院实验室检测代谢指标。同时早晨静脉血5ml，加入EDTA 抗凝试管中，严格按照MTHFR C677C/T基因检测试剂盒（深圳奥萨医药有限公司）说明书的操作步骤提取基因组DNA，并置于-20℃冰箱保存。（3）引物序列：参照文献［6］设计引物，上游引物：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’， 下 游 引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；引物由美国ABI 公司合成。（4）基因多态性检测：采用PCRTaqMan 探针技术检测MTHFR C677T 基因（SNP ID：rs1801133）多态性，由浙江友莱医疗器械有限公司完成。具体如下：由美国 ABI 公司设计的两条MGB 探针，一条以VIC 荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM 荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。PCR 反应体系：10×PCR buffer 2μl，25mM MgCl21.12L，rTaq 0.8μl，引 物 探 针 0.25μl，DNA 模 板4 μl，100mM dNTP 0.16μl，dd H2O 11.67μl；反应条件：50℃ 2min，95℃预变性2min，95℃ 15s，60℃ 1min，共45 个循环。PCR 扩增在ABI 7500 实时荧光 PCR 仪上进行。产物扩增后使用Genotyping 软件分析MTHFR C677T 基因分型数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件。符合正态分布、方差齐性时计量资料以（）表示；计数资料以n（%）表示；基因型及等位基因频率分布差异比较采用χ2检验；不同基因型间Hcy 水平比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验；数量性状位点分析采用单因素线性回归；采用多因素Logistic 回归分析影响急性腔隙性脑梗死的危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料 见表1。

2.2 基因型和等位基因频率分布比较 见表2。

表1 两组一般临床资料比较（）

表1 两组一般临床资料比较（）

组别 例数 年龄(岁) SBP(mmHg) DBP(mmHg) FBS(mmol/L) UA(μmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) 叶酸(ng/ml) Hcy(μmol/L)观察组 146 63.21±9.97 148.09±21.05 83.21±15.45 6.39±2.26 338.75±85.75 2.57±0.79 1.20±0.26 4.44±1.03 1.49±1.37 6.83±3.72 11.15±7.1对照组 132 61.17±9.97 133.58±16.41 79.39±10.57 5.67±1.25 349.33±105.54 2.74±0.88 1.31±0.88 4.76±1.05 1.90±1.37 7.71±3.49 9.96±6.54 t值 1.702 6.003 2.118 3.290 0.892 1.644 1.382 2.541 2.948 1.812 1.319 P值 0.090 ＜0.001 0.035 0.001 0.373 0.101 0.168 0.012 0.004 0.072 0.188

表2 两组MTHFR C677T基因型和等位基因频率分布比较［n（%）］

2.3 观察组和对照组内MTHFR C677T 不同基因型间的Hcy 水平比较 见表3。

表3 两组MTHFR C677T不同基因型间的Hcy水平比较［μmol/L，（）］

表3 两组MTHFR C677T不同基因型间的Hcy水平比较［μmol/L，（）］

注：与同组CC型比较，*P＜0.001；与同组CT型比较，#P＜0.001

组别 n CC CT TT F值 P值观察组 146 9.77±3.56 9.40±3.14 15.77±12.00 *# 11.592 ＜0.001对照组 132 8.65±3.01 9.20±3.51 17.34±15.54*# 11.632 ＜0.001

2.4 MTHFR C677T 基因多态性与代谢指标的数量性状（QTL）分析 以MTHFR C677T 基因多态性作为自变量，将表1 各代谢指标依次作为因变量，分别分析各代谢指标与该基因多态性是否存在线性回归。结果发现本实验位点与叶酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在线性回归关系，差异有统计学意义，与其它代谢指标差异无统计学意义。

2.5 多因素Logistic 回归分析 以急性腔隙性脑梗死为因变量，以MTHFR C677T 等位基因T、年龄、性别、高血压、冠心病、糖尿病、吸烟史、饮酒史、低高密度脂蛋白血症、高胆固醇血症、HHcy、颈动脉斑块作为自变量进行Logistic 回归分析。结果发现在本实验中MTHFR C677T 等位基因T、高血压、冠心病、颈动脉斑块者对急性腔隙性脑梗死发病有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

本研究发现观察组及对照组内携带TT 型的Hcy水平均高于同组携带CC 型及CT 型的Hcy 水平。另外，本研究中MTHFR C677T 基因多态性与代谢指标的数量性状分析示MTHFR C677T 基因多态性与叶酸（r=0.293，β=-1.381，t=-4.591，P＜0.001）、Hcy（r=0.332，β=2.966，t=5.481，P＜0.001）存在线性回归关系，提示MTHFR C677T 等位基因T（rs1801133）是与Hcy、叶酸相关的数量性状位点。

有关HHcy 与心脑血管疾病的相关性一直是国内外研究的热点，有研究认为HHcy 是脑梗死的独立危险因素［1］，但HHcy 与脑梗死的各亚型均相关还是与某一种亚型相关，目前尚无定论。Piao X 等［7］通过荟萃分析认为HHcy 与腔隙性脑梗死有关。本研究Logistic 回归分析提示HHcy 对急性腔隙性脑梗死的发病影响无统计学意义，与Piao X 等的研究结果不一致，但与Zhang 等［8］的实验结果一致。本研究中HHcy 与急性腔隙性脑梗死的相关性出现阴性结果可能原因如下：（1）腔隙性脑梗死是多基因遗传与多环境因素共同作用的复杂性疾病，目前认为其基本病因可能是小血管动脉硬化。高血压病是腔隙性脑梗死的重要危险因素，本文中观察组与对照组间的基线资料提示两组间收缩压与舒张压差异有统计学意义，且Logistic 回归分析示高血压病是急性腔隙性脑梗死的独立危险因素，这与上述文献结论一致。HHcy 对急性腔隙性脑梗死的意义有可能被强效危险因素（如高血压、MTHFR C677T 等位基因T 等）间的交互作用所掩盖；（2）Hcy的代谢受MHFR C677T 的影响较大，MHFR C677T 突变率（携带等位基因T）受种族、地域差异影响较大，在欧美地区突变率呈南高北低的趋势，而在中国呈南低北高的趋势［9］，台州属于低突变率地区。因此，出现实验结论不一致且本实验提示HHcy 与急性腔隙性脑梗死的发病无关有可能与选择的受试人群有关；（3）HHcy 可能与急性腔隙性脑梗死发病无关；（4）本研究的样本量偏少。因此未来应扩大样本量进一步明确HHcy 与急性腔隙性脑梗死的相关性。

MTHFR 基因定位于1 号染色体的1p36.3 上，C677T 是该基因常见的突变位点，其功能是催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，参与Hcy 的再甲基化过程。本研究发现观察组和对照组间基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05），但Logistic 回归分析示MTHFR C677T 等位基因T 是急性腔隙性脑梗死的独立危险因素［OR（95%CI）=1.932（1.027，3.632），P=0.041），提示MTHFR C677T 携带T 等位基因者患急性腔隙性脑梗死的风险是非T 等位基因携带者的1.932 倍。本研究结果认为，MTHFR C677T 是台州地区急性腔隙性脑梗死的重要遗传危险因素。但对于该基因与急性腔隙性脑梗死直接相关还是通过与传统危险因素（如高血压、糖尿病等）的交互作用再导致急性腔隙性脑梗死的发生目前尚无定论，且相关研究较少。在本研究中观察组与对照组间的收缩压与舒张压差异有统计学意义，Logistic回归分析示高血压病是急性腔隙性脑梗死的重要危险因素，提示MTHFR C677T 基因多态性可能通过与高血压的交互作用影响腔隙性脑梗死的发生。