百里醌通过PTEN/AKT信号通路抑制平滑肌细胞增殖和迁移以及机制研究

赵玮 姜文兵 朱宁 赵旭勇 吴悠扬

急性心肌梗死（AMI）是指冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，常并发心律失常、休克或心力衰竭，可危及患者生命。目前随着冠状动脉介入技术以及器械的快速发展，经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已成为ST 段抬高的心肌梗死的标准疗法。伴随支架的大量应用，支架内再狭窄而导致冠脉再次堵塞的事件也随之频现，虽然支架已经从传统的裸金属支架发展至现在的药物支架，但是晚期支架内再狭窄的发生仍是不可忽视的问题。目前临床研究显示［1］，生物可降解支架的出现可能解决支架植入术后再狭窄这一问题，但是基于目前的临床研究疗效仍然不确切，还需进一步改进支架或者寻找其它有效药物治疗。支架植入术后再狭窄的发生主要是由于支架对冠脉的损伤刺激平滑肌细胞增殖、迁移的增加，最终导致血管堵塞，因此促进平滑肌细胞的凋亡有助于减少支架内再狭窄的发生。以往研究表明［2］百里醌能抑制细胞增殖从而对大鼠缺血再灌注损伤起到保护作用，所以本研究旨在观察百里醌能否抑制平滑肌细胞的增殖、迁移以及其作用的机制，为临床应用于减少PCI 术后支架内再狭窄奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂 SPF 级SD 雄性大鼠购自武汉医科大学动物中心，百里醌购自上海恒斐生物科技有限公司（厂家：Solarbio）DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司），TRAM-34、胰蛋白酶、MTT（Sigma 公司），兔抗鼠平滑肌α-actin（α-SM A）抗体、S-ABC 过氧化物酶试剂盒、DAB 显色试剂盒（上海西唐生物科技有限公司），TRIzol（Invitrogen 公司），Western blot检测试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

1.2 方法 （1）颈动脉平滑肌细胞分离及培养：选取250～300g SD 雄性大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，麻醉显效后用手术刀切开颈部皮肤，分离出颈动脉放入生理盐水里漂洗净血管。用剪刀剪开血管，镊子小心刮去上层的内皮细胞。在20%FBS 的DMEM中用剪刀剪碎平滑肌细胞层，静置培养3～4d 后可见平滑肌细胞爬出，用PBS 洗3 次后继续培养，直到细胞长满培养皿开始传代，传代3～8 代后细胞可用于实验。（2）实验分组及干预措施：分离培养颈动脉平滑肌细胞分为空白对照组、低剂量百里醌组（1mg/L）、中剂量百里醌组（10mg/L）和高剂量百里醌组（100mg/L），除对照组外，百里醌各剂量组细胞分别以上述不同浓度的百里醌组进行干预。（3）划痕实验观察平滑肌细胞迁移情况：取4～7 代颈动脉平滑肌细胞置于0.5%FBS 的DMEM 培养基培养24h 后，用200μl 枪头在中间划出一条直线，即在线内无细胞存在，40ng/ml 血小板衍生长因子（PDGF）刺激细胞24h，倒置显微镜下观察载划痕处细胞的迁移情况。（4）MTT 法检测平滑肌细细胞增殖活性：取4～7 代颈动脉平滑肌细胞0.5%FBS 的DMEM 培养24h 后，40ng/ml 血小板衍生长因子（PDGF）刺激细胞24h，MTT 试剂盒检测各时间点细胞增殖情况。（5）细胞增殖及凋亡检测：利用以下染色方法对细胞增殖、凋亡进行评估：①利用α-SMA和PCNA 免疫组织化学染色检测颈动脉平滑肌细胞增殖情况；②TUNEL 染色检测颈动脉平滑肌细胞的凋亡情况，即显微镜下计数每个视野中凋亡细胞数（阳性细胞数）和细胞总数，计算细胞凋亡率［凋亡率=（阳性细胞数/细胞总数）×100%］。（6）Western blot 检测：用各干预因素干预平滑肌细胞48h 后，按照说明书裂解细胞，提取总蛋白后电泳、转膜、封闭、再孵育，western blot 检 测PTEN、P-AKT、AKT、Bax 和Bcl-2蛋白的表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行分析，数据均以（）表示，两组间的比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 百里醌对平滑肌细胞迁移面积的影响 空白对照组迁移面积为（0.89±0.05）%，低剂量百里醌组迁移面积为（0.67±0.03）%，中剂量百里醌组迁移面积为（0.45±0.03）%，高剂量百里醌组迁移面积为（0.31±0.02）%。与空白对照组比较，百里醌各剂量组迁移面积明显减小，迁移面积的缩小呈剂量依赖性变化，即百里醌剂量越大，迁移面积越小，各组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 百里醌对平滑肌细胞增殖的影响 MTT 检测结果显示（见图1），百里醌各组加入不同浓度的百里醌后，与空白对照组比较，百里醌各剂量组OD 值明显降低；百里醌各剂量组比较，其OD 值呈剂量依赖性趋势改变，即剂量越大OD 值越小，三组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。对各组细胞进行免疫组织化学染色发现（见图2、3），与空白对照组比较，百里醌各剂量组α-SMA 和PCNA 表达阳性率明显降低，百里醌各剂量组α-SMA 和PCNA 表达阳性率也呈剂量依赖性趋势改变，即剂量越大α-SMA 和PCNA 表达阳性率越小，三组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。以上实验结果均表明，百里醌能抑制平滑肌细胞增殖，且剂量越大作用越明显。

图1 各组细胞不同时间点增殖活性比较

图2 各组α-SMA免疫组织化学染色

表1 各组α-SMA和PCNA免疫组织化学染色检测细胞阳性率比较［%，（）］

表1 各组α-SMA和PCNA免疫组织化学染色检测细胞阳性率比较［%，（）］

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与低剂量百里醌组比较，#P＜0.05；与中剂量百里醌组比较，△P＜0.05

组别 α-SMA细胞阳性率 PCNA细胞阳性率低剂量百里醌组 55.64±2.58* 47.42±1.15*中剂量百里醌组 42.98±2.75*# 33.32±1.12*#高剂量百里醌组 30.49±1.12*#△ 19.81±1.36*#△空白对照组 61.50±1.22 53.08±0.54

2.3 百里醌对平滑肌细胞凋亡的影响 对各组细胞TUNEL 染色（见图4），与空白对照组比较，低剂量百里醌组和中剂量百里醌组细胞凋亡率无明显差异（P＞0.05），而高剂量百里醌细胞凋亡率升高，与其他组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

图3 各组PCNA免疫组织化学染色

图4 各组细胞TUNEL染色

表2 各组细胞凋亡率比较［%，（）］

表2 各组细胞凋亡率比较［%，（）］

注：与其它组比较，*P＜0.05

组别 细胞凋亡低剂量百里醌组 10.14±1.55中剂量百里醌组 9.85±3.97高剂量百里醌组 24.13±3.55*空白对照组 10.16±1.94

2.4 百里醌对平滑肌细胞蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示，百里醌各剂量组的PTEN 和Bax的表达量显著高于对照组，而P-AKT、AKT 和bcl-2蛋白的表达量显著低于对照组；百里醌各剂量组之间比较，PTEN 和Bax 蛋白的表达量随着剂量增大而升高，P-AKT、AKT 和Bcl-2 蛋白的表达量随着剂量增大而降低，各组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）（见图5）。

3 讨论

图5 各组PTEN、P-AKT、AKT、Bax和bcl-2蛋白表达量比较（注：与空白对照组比较，＊P＜0.05；与低剂量百里醌组比较，#P＜0.05；与中剂量百里醌组比较，△P＜0.05）

成熟动物的血管平滑肌细胞（SMCs）是高分化和高特异性的细胞，其主要功能是通过调节血管张力和直径来调控血管的收缩和舒张，进而控制血压和血流的分布。通常情况下在成熟血管中平滑肌细胞极少处于增殖状态以及表现出分泌活性［3］，但是在应对血管损伤、炎症、血流剪切力增加的时候，平滑肌细胞受到各种生长因子比如血小板源性生长因子（PDGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等的刺激而处于活跃的增殖和迁移状态，最终促进血管重构，导致管腔狭窄［4］，进一步引发血管相关的疾病，如支架术后再狭窄。

百里醌是黑种草黑籽精油的主要活性成分，主要具有抗炎和抗癌作用。此外研究发现百里醌具有镇痛、抗糖尿病、抗组胺作用，能够缓解呼吸系统疾病、风湿性关节炎、动脉粥样硬化和高血压等药理作用［5］。最重要的是百里醌的抗癌活性在多种动物模型和肿瘤细胞株被证明是有效的［6-7］。百里醌能抑制转录激活因子3（STAT3）的激活，导致人类多发性骨髓瘤细胞凋亡［8］。在多发性骨髓瘤、鳞状细胞癌、人类前列腺癌细胞株中百里醌的抗增殖效应主要与抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）有关。另外有研究显示，百里醌能通过增加Bax/Bcl-2 比值促进细胞凋亡和减少肿瘤增生［9］，同时百里醌也能通过上调PTEN 从而抑制下游AKT 的磷酸化来抑制肿瘤细胞的增殖［10］。PTEN位于人类染色体10q23.3，其具有调节细胞生长、凋亡的作用，并与细胞外基质的蛋白相互作用，抑制细胞的迁移、扩散和粘附。基于其在多种肿瘤中的高频率突变，PTEN 被认为是一种肿瘤抑制基因。随后有研究表明PTEN 同时具有蛋白质酪氨酸磷酸酶和三磷酸肌醇磷酸酶活性。PTEN 主要通过抑制PI3K/AKT 通路介导细胞的凋亡［11］。

以往研究表明PTEN 的上调能抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移［12］，AKT1 能通过FoxO3a 和APAF1促进血管平滑肌细胞凋亡从而减缓动脉重构与动脉粥样硬化。作者在细胞凋亡检测中发现，高剂量百里醌可使平滑肌细胞大量凋亡。细胞迁移和增殖影响检测中，均显示随着百里醌剂量的加大，其抑制平滑肌细胞迁移和增殖作用越明显。同时剂量的增加对PTEN/AKT 信号通路相关蛋白的影响越大，高剂量百里醌上调PTEN 蛋白和下调P-AKT 蛋白、AKT 蛋白表达。通过检测Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白发现，Bax 蛋白随剂量增大表达水平上升，Bcl-2 蛋白表达水平下降。通过以上一系列结果，作者推测，百里醌可上调PTEN 蛋白和Bax 蛋白的表达，下调P-AKT 蛋白、AKT 蛋白和Bcl-2 蛋白的表达，通过抑制PI3K/AKT 通路活化和提高Bax/Bcl-2 比值，进一步抑制细胞增殖、迁移和介导细胞的凋亡。

综上所述，百里醌能够抑制平滑肌细胞增殖和迁移，其作用机制与PTEN/AKT 信号通路活化相关。然而本研究仍有不足之处，百里醌是由不同成分组成的中药提取物，想要了解哪些活性成分具有抑制平滑肌细胞增殖和迁移作用，仍需进一步研究。