前列腺按摩后尿沉渣AMACR检测在前列腺癌早期诊断中的研究

李峰 马权 陈永良 李东章 李王坚

前列腺癌是欧美男性发病率第一，病死率第二的恶性肿瘤［1］。在国内前列腺癌近年来呈快速增长趋势［2］。目前，前列腺癌的诊断主要依靠血清前列腺特异抗原（PSA）、直肠指诊以及前列腺穿刺活检。PSA 在前列腺癌的早期诊断中起着重要作用［3］，但PSA 水平在前列腺良性疾病及增生时也会升高，导致其在早期前列腺癌的诊断中特异性与敏感性均不高［4］，尤其是PSA 在4～10 的灰区患者中，检出率仅为25%［5］，且PSA＜10 的患者多为早期患者，前列腺癌干预效果明显优于进展期患者［6］。α-甲酰辅酶A 消旋酶（AMACR）是一种线粒体酶，其蛋白与RNA 在前列腺癌组织中均高表达［7］，特异性接近100%，敏感性97%，是良好的诊断标记物［8］。本研究通过收集本院穿刺前列腺患者按摩后的尿液进行尿沉渣细胞中AMACR 评分的分布进行研究，探讨其在前列腺癌诊断以及PSA 灰区患者中的诊断作用，旨在建立更高效的无创诊断模型。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2015 年3 月至2017 年3月在本院行前列腺穿刺的PSA 升高患者198 例。所有研究对象均签署知情同意书，所有患者均行经直肠B超引导下前列腺穿刺活检术，穿刺针数为6～12 针。所有穿刺组织病理均由两位高年资病理科医师一致确认。本研究将患者分为两组，穿刺阳性组85 例，穿刺阴性组113 例。198 例样本临床信息见表1。

表1 研究人群的临床和病例特征［n（%）］

1.2 标本收集与处理 所有患者行前列腺检查前由医师行前列腺按摩。收集按摩后排尿的初始段尿液约50ml，使用HiPure Total RNA Mini Kit（Magen，China）按说明书提取尿沉渣中总RNA。使用Nanodrop 2000微量光度计测定RNA 浓度与纯度。使用TransPlex® Complete Whole Transcriptom Amplification Kit（WTA2，SIGMA，USA）全转录组扩增试剂盒按说明书逆转录cDNA。

1.3 实时定量PCR 检测尿沉渣中AMACR mRNA 和PSA mRNA 的表达 使用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo QPK-201，Japan）试剂盒检测尿沉渣中AMACR mRNA 与PSA mRNA 的表达。使用Applied Biosystem StepOnePlusTM Real-Time PCR System进行定量检测。检测数据由StepOne Software version v2.1（Applied Biosystem，USA）获得。所有实验均设置3 个重复反应。AMACR 表达量采用评分方法计算，AMAMCR 评分=AMACR mRNA/PSA mRNA×1000=2Ct（PSA）-Ct（AMACR）×1000。

1.4 统计分析 采用SPSS 21.0 与EmpowerStats 进行统计分析。分析AMACR 为非正态分布，使用两样本比较的秩和检验分析穿刺阳性与阴性患者的差异。使用spearman 检验AMACR 评分与临床指标相关性。使用logistics 回归分析建立AMACR 评分与血清PSA 的logistics 回归模型。用受试者工作特征曲线（ROC）确定最佳临界值、曲线下面积（AUC），对AMACR 评分、血清PSA 及两者联用的诊断效能进行评价。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMACR 评分在前列腺疾病穿刺患者穿刺结果的预测作用 在全部穿刺患者中，前列腺穿刺阳性患者的AMACR 评分明显高于前列腺穿刺阴性患者（见图1A，P＜0.001），与血清PSA 结果相同（见图1B，P＜0.001）。通 过Spearman 检 验 发 现AMACR 评 分 与tPSA、fPSA/tPSA、DRE、PSA 密度相关，与年龄、前列腺体积、Gleason 评分无关（见表2）。使用logistic回归分析建立血清PSA、AMACR 评分以及两者合用的诊断模型。血清PSA 在全部前列腺穿刺患者中的优势比为5.3（95%CI：0.649～0.793，P=0.037），AMACR在全部前列腺穿刺患者中的优势比为4.5（95%CI：0.647～0.788，P=0.036）。两者合用模型方程为：logit（P）=-1.88692 +0.05759*PSA +0.00239*AMACR 评分。经ROC 分析，使用血清PSA，AMACR 以及两者合用的AUC 分别为0.721、0.717 和0.798。在全部患者中AMACR 评分与血清PSA 的诊断价值无统计学差异（P=0.947），两者合用优于血清PSA（P=0.009）或AMACR 评分（P=0.007）。由此得出，AMACR 评分在前列腺穿刺患者中有良好的预测作用，将AMACR 评分与血清PSA 联用可以明显提高预测总体前列腺穿刺患者穿刺结果的准确性。

图1 AMACR评分在全部前列腺疾病穿刺患者穿刺结果的预测作用图

表2 AMACR评分与所有患者临床变量之间的关系

2.2 AMACR 评分在PSA“诊断灰区”的前列腺穿刺患者中的预测作用 在灰区患者中AMACR 评分与临床指标无显著相关性（见表3）。AMACR 评分呈非正态分布，采用两样本比较的Mann-Whitney 检验。在PSA“诊断灰区”的穿刺患者中，穿刺阳性AMACR 评分明显高于阴性（见图2A，P=0.004），而血清PSA 无法区分阴性与阳性患者（见图2B，P=0.5210）。在血清PSA4-10 患者中使用logistics 回归分析血清PSA 与AMAMCR 评分与PCa 的相关性，并建立血清PSA 和AMACR 评分的logistics 回归模型。血清PSA 在穿刺阳性与阴性患者的优势比为2.3（95%CI：0.407～0.683，P=0.069），AMACR 评分在前列腺穿刺阳性患者和阴性患者的优势比为4.9（95%CI：0.576～0.820，P=0.062）。经AUC-ROC 分析，血清PSA、AMACR 评分和两者联用曲线下面积为0.545、0.698 和0.707。AMACR 评分诊断价值有优于血清PSA 的趋势，但两者相比无统计学差异（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 评分两者联用相比血清PSA显示出了更高的临床诊断价值（P=0.064）。

表3 AMACR评分与灰区患者临床变量之间的关系

图2 AMACR评分在PSA“诊断灰区”的前列腺穿刺患者中的预测作用图

2.3 临床决策曲线评估诊断模型准确性 对全体患者以及灰区患者进行临床决策曲线评估，基本模型包含PSA、年龄、fPSA/PSA、DRE 与前列腺体积，通过比较基础模型联合AMACR 评分与单用基础模型的临床决策曲线发现，在全体患者中，基础模型联合AMACR评分在阈值概率＞35%时患者净收益优于单用基础模型，获得最大净收益，且能够避免；在PSA 灰区人群中，基础模型联合AMACR 评分在阈值概率＞30%时优于单用基础模型（见表4）。

表4 基本模型和基本模型联合AMACR与所有患者相比较的净收益在相同范围内的不同阈值概率

3 讨论

AMACR 研究多局限于肿瘤组织，其在前列腺癌组织中高表达，其敏感性高达82%～100%，特异性高达79%～100%，具有良好的组织诊断学价值［8］。但由于组织化学染色评分的主观局限性，不能精确地对其表达量与前列腺癌关系进行研究。在组织AMACR的研究中，Al-Maghrebi 等［9］通过对前列腺组织中AMACR mRNA 水平的研究发现，AMACR RNA 的表达水平，不但能区分前列腺癌与前列腺良性疾病，同时也与肿瘤分期与Gleason 评分相关。但同时也有观点认为，在前列腺组织中单独使用AMACR 作为诊断标记物可能存在误诊的可能，因为其在良性腺体以及高级别上皮内瘤变（PIN）中也有表达［10］。Sroka 等［11］研究显示，尿液中AMACR 蛋白的表达水平并不能区分前列腺良恶性疾病，其诊断能效并不优于血清PSA。Zielie 等［12］首先使用AMACR 评分的方法，收集21 例患者的按摩后尿液，对其AMACR RNA 表达量进行评分，初步显示出AMACR 评分在西方人中的诊断价值。Ouyang 等［13］通过将尿液中AMACR RNA 与PCA3 联合使用，提高了穿刺阴性患者的前列腺癌检出率。本研究应用AMACR 评分的方法，评价其在中国人群中的诊断效能。

本研究通过对本院穿刺的198 例患者DRE 后的尿沉渣样本中AMACR 评分分布进行分析后发现，AMACR 评分在总体以及“PSA 诊断灰区”患者中呈非正态分布，在全部穿刺患者中AMACR 评分诊断效能较好，AUC 为0.717，与血清PSA 相比无统计学差异（P=0.947），说明血清PSA 在前列腺癌诊断中仍有较大价值。同时，AMACR 评分与血清PSA 合用能显著提高前列腺穿刺患者的诊断能效（AUC=0.798），优于血清PSA 与AMACR 评分单独使用（P=0.009、P=0.007）。说明应用AMACR 评分与血清PSA 联合诊断模型能显著提高前列腺癌的预测准确性。

在PSA 4～10 的 灰 区 患 者 中，血 清PSA 并 不能区分前列腺良恶性肿瘤，无明显的诊断价值（AUC=0.545）。AMACR 评分诊断价值有优于血清PSA的趋势，但两者相比无统计学差异（P=0.117）。血清PSA 和AMACR 评分两者联用显示出了更高的临床诊断价值。这个研究结果受限于样本量较小，有待于后续大样本量研究进行验证。

本研究的不足为样本量较小，且为单中心数据，在临床应用前还需要大规模临床样本进行验证，检测指标也仅限于AMACR 评分与PSA，在下一步的研究中，应纳入更多的诊断指标，以提高该模型的诊断能效。