四逆汤联合Imatinib抑制乳腺癌耐药细胞生长的研究

林巾雄 赵华军 刘伦铭

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，是造成女性死亡的第二大癌症［1］，目前以手术、化疗、放疗及内分泌治疗为主。氟维司群为乳腺癌内分泌治疗的一线用药，长期用药通常导致获得性耐药问题。因此，耐药问题已成为治疗肿瘤的一大障碍。有研究表明，中西医结合能显著提高治疗效果，减少化疗药物所带来的耐药问题，减少放疗、化疗的副作用，延长患者生存期［2］。在氟维司群耐药细胞中，EGFR 异常升高［3］，而同时抑制EGFR 和c-ABL 能有效抑制氟维司群耐药细胞的生长。研究表明，EGFR 可能是四逆汤一个潜在的作用靶点［4-5］。作为温阳法的代表方，四逆汤药理作用广泛。众多研究表明［6-7］，四逆汤能够诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制细胞的增殖。因此，作者旨在探索四逆汤联合伊马替尼（c-Abl 抑制剂）能否有效抑制氟维司群耐药细胞的生长及其诱导凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞株来源 人乳腺癌T47D 细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药品与试剂 四逆汤组成药物制附片、干姜、炙甘草，均购自浙江中医药大学杭州滨江中医门诊部。氟维司群（Fulvestrant）、伊马替尼（Imatinib），美国Sigma-Aldrich 公司；新生牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM/F12 培养基，美国Gibco 公司；青霉素、链霉素，生工生物工程有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）（1 ∶250），美国Gibco 公司；碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；DMSO，美国Sigma 公司；Annexin Ⅴ/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒，BD 公司；Bid（#1008-1）、Bcl-xl（#2764）、Bcl-2（#2870）、GAPDH（#5174）、β-tubulin（#2128）、HER2（#4290），美国Cell Signaling Technology 公司；PR（sc-538），美国Santa Cruz 公司；ER（#1115-1），美 国abcam 公 司；Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies（二抗），Cell Signaling Technology公司；ECL 显影液，BIO-RAD 公司。

1.3 方法 （1）MTT 法检测细胞生长抑制实验：取对数期生长的耐药细胞T47D/Ful，调整细胞浓度，接种至96 孔板，每孔加入100μl 细胞悬液，并控制其细胞浓度为3000 个/孔，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养18h 至贴壁后，每孔加入10μl 药物，设置系列给药梯度（四逆汤：10mg、15mg、20mg，生药25mg/ml，伊马替尼：15μm、20μm），每个浓度设置4 个副孔，另外设置空白对照组，每孔加入10μl培养基，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养48h 后，每孔加入20μl MTT 溶液，继续放回培养箱中，4h 后每孔加入200μl 三联液，将96 孔板放至外用37℃恒温培养箱中作用18h 后，用Bio-Rad 酶标仪在570nm 时测定吸光度OD 值，最后计算细胞的相对存活率以及相对抑制率。（2）联合指数及等效线分析法：将MTT 法计算得到的细胞存活率以及对应的药物浓度用联合用药软件CompuSyn 分析四逆汤与伊马替尼联合用药的联合指数（Combination Index，CI），并生成等效线图。CI 指数定义如下：＞1，拮抗作用；=1，叠加作用；＜1，协同作用。（3）流式细胞术检测细胞凋亡：取对数期生长的氟维司群耐药乳腺癌细胞T47D/Ful，消化、离心后，调整细胞浓度（8×105个细胞），接种至6cm 皿，18h 后至细胞贴壁，设置对照组、给药组（伊马替尼组：20μm，四逆汤组：25mg 生药/ml，四逆汤、伊马替尼联合组），加入药物作用48h 后，收集细胞，将收集后的细胞用1×Binding Buffer 重悬细胞，分别吸取100μl 细胞悬液至EP 管中，加入FITC-Annexin V 和7-AAD 避光各染10min。最后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。（4）Western Blot 检测相关蛋白：取对数期生长的氟维司群耐药乳腺癌细胞T47D/Ful 接种至6cm 皿（8×105个细胞），待细胞贴壁后，随机分组为对照组、四逆汤组（生药25mg/ml）、伊马替尼组（20μM）、四逆汤联合伊马替尼组，在培养箱中继续培养48h，各组加入细胞裂解液，于冰上裂解30min，12000r/min、10min，收集上清液、按照碧云天BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，接下来将处理后的蛋白上样，用SDS-PAGE 分离目标蛋白，然后用湿转法转至PVDF 膜，将封闭后的蛋白条带用Bid、Bclxl、Bcl-2、GAPDH 等一抗孵育过夜，加入对应的二抗溶液，孵育2h，ECL 显影液显影、化学发光仪曝光。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计方法。计量资料以（）表示，各组间数据的比较采用t 检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 T47D/Ful 耐药细胞敏感性及相关蛋白质表达的鉴定 本实验中所用的氟维司群耐药乳腺癌细胞T47D/Ful 由人乳腺癌细胞T47D 经过氟维司群药物压力筛选，并采用0.5μm 氟维司群培养约1 年时间得到。作者在实验展开前对其氟维司群敏感性以及相关蛋白表达进行鉴定。实验结果显示（见图1），耐药细胞T47D/Ful相较于亲代细胞T47D，其对氟维司群的敏感性显著降低，且耐药细胞ER、PR 以及HER2 均为阴性表达，表明本研究中所用的T47D/Ful 细胞具有氟维司群耐药细胞ER、PR 以及HER2 均为阴性的特点，可用于后续的研究。

图1 T47D/Ful对氟维司群敏感性及ER、PR和HER2蛋白表达鉴定（A：T47D/Ful耐药细胞相较于亲代细胞对氟维司群敏感性显著下降。B：T47D/Ful耐药细胞呈现ER、PR及HER2三阴性表达）

2.2 四逆汤与伊马替尼单独用药及联合用药对氟维司群耐药细胞T47D/Ful 增殖的影响 实验结果显示（见图2），四逆汤联合伊马替尼能显著抑制耐药细胞T47D/Ful 的生长，图3A 显示，四逆汤生药25mg/ml、伊马替尼20μm 剂量下，具有最佳的联合效果，且联合用药相较于单独用药具有显著性差异；图3B 显示，在四逆汤生药25mg/ml、伊马替尼20μm 剂量下，具有最小的CI 值，CI＜1，表明此剂量下具有最佳的协同效果。

图2 四逆汤联合伊马替尼对耐药细胞T47D/Ful的生长抑制作用（A：MTT法测定四逆汤和伊马替尼对T47D/Ful细胞的生长抑制作用。B：联合指数及等效线分析法显示，四逆汤联合伊马替尼能协同抑制耐药细胞T47D/Ful的生长）

2.3 流式细胞术检测四逆汤与伊马替尼作用后氟维司群耐药细胞T47D/Ful 凋亡情况 流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验结果显示（见图3A、B），四逆汤及伊马替尼单独及联合作用于T47D/Ful 细胞均能有效诱导细胞凋亡，而相较于单独用药，联合用药能更加显著地诱导耐药细胞凋亡。上述结果表明，联合用药能有效诱导氟维司群耐药细胞T47D/Ful 凋亡。

2.4 Western Blot 检测四逆汤与伊马替尼作用后T47D/Ful 细胞凋亡相关蛋白 Western Blot 结果显示（见图3C），Bid 蛋白表达水平升高，Bcl-2、Bcl-xl 蛋白表达水平下降，表明四逆汤联合Imatinib 抑制氟维司群耐药细胞T47D/Ful 生长是通过诱导细胞凋亡实现的。

图3 四逆汤与伊马替尼单独、联合作用对耐药细胞T47D/Ful凋亡的影响及凋亡相关蛋白Bid、Bcl-xl、Bcl-2的表达情况（A、B：四逆汤联合伊马替尼能显著上调耐药细胞T47D/Ful的凋亡比例。C：四逆汤联合伊马替尼能显著上调耐药细胞Bid的表达、下调Bcl-2、Bcl-xl的表达）

3 讨论

近些年来，随着对中药研究的深入，中药在抗肿瘤方面日益展现出其独特的优势。现代研究表明，四逆汤具有提高免疫功能、抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡等作用［7］。作为一个ER 拮抗剂，氟维司群（Fulvestrant）在乳腺癌内分泌治疗中起着重要作用［8］，然而在长时间的治疗后，目前大部分患者均产生了耐药性。而研究表明［9-10］，氟维司群内分泌治疗失败后，目前尚无有效方法治疗氟维司群耐药的乳腺癌。因此，寻找新的途径治疗氟维司群耐药乳腺癌，是目前乳腺癌治疗亟待解决的问题。

Liu 等［3］研究表明，用拉帕替尼（Lapatinib，EGFR 抑制剂）和伊马替尼（Imatinib，c-Abl 抑制剂）能有效抑制氟维司群耐药细胞FRBC 的生长，且FRBC细胞呈类三阴性性状，即ER、PR 及HER2 均为阴性表达。因此，为了研究四逆汤联合伊马替尼是否也能抑制氟维司群耐药细胞T47D/Ful 的生长，作者首先通过MTT 实验、联合指数及等效线分析法发现四逆汤联合伊马替尼能协同抑制氟维司群耐药细胞T47D/Ful 的生长。

随后，作者对四逆汤联合伊马替尼抑制耐药细胞T47D/Ful 生长的机制进行研究。发现四逆汤联合伊马替尼能显著诱导T47D/Ful 细胞凋亡比例的升高，且联合用药组相较于单独用药组具有显著性差异，表明四逆汤联合伊马替尼的效果优于单独用药。细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，其中，内质网应激介导凋亡主要是通过调节Bcl-2 家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡、调节胞内钙离子浓度，从而介导细胞凋亡。本实验结果显示，四逆汤联合伊马替尼能显著诱导促凋亡蛋白Bid 的表达、抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Bcl-2的表达。

本研究通过系列实验，初步探究了四逆汤联合伊马替尼对氟维司群耐药乳腺癌细胞T47D/Ful 的作用及机制，阐明了四逆汤联合伊马替尼能通过诱导细胞凋亡，从而协同抑制耐药细胞T47D/Ful 的生长。这为临床治疗氟维司群耐药乳腺癌提供了一种新的治疗策略与思路，对于四逆汤联合伊马替尼抑制氟维司群耐药细胞生长的作用是否存在其它调控机制，有待本课题组进一步研究。