曲普瑞林抑制子宫平滑肌瘤细胞的性激素受体表达、诱导瘤细胞凋亡

杨静，杨娟，徐亚吉

（1四川省林业中心医院妇产科，成都 610000；2重庆新桥医院妇产科，重庆 400037；3 成都大学基础医学系，成都 610000）

子宫平滑肌瘤简称子宫肌瘤，是女性生殖系统最常见的良性肿瘤之一，约有30%～50%的女性患有子宫肌瘤[1]。子宫肌瘤引起一系列妇科症状，包括盆腔疼痛及出血等[2]。目前尚无有效的药物来治疗子宫肌瘤，许多患者最终需行子宫切除术[3]。美国每年约有60万例患者进行子宫切除术，其中约一半患者与子宫肌瘤有关[4]。

研究表明[5]，子宫肌瘤的发展与性激素水平及其受体有关。在子宫肌瘤中，雌激素和孕激素之间通过自分泌和旁分泌作用互相调节，雌激素可增加肌瘤细胞中孕激素受体含量，孕激素又可进一步促进雌激素含量，并且雌激素和孕激素能共同促进子宫肌层平滑肌细胞转变成肌瘤细胞和进一步共同促进平滑肌瘤的生长[6]。有研究表明[7]，促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone agonists,GnRH）的激动剂（gonadotropin releasing hormone agonists, GnRHA）能有效改善子宫肌瘤的症状，其机制主要是由于GnRHA刺激后，雌激素和孕激素水平一过性升高，随即下降，使垂体中GnRH受体表达下调。GnRH受体也在垂体外的组织例如子宫内膜以及子宫肌层中表达[8]。GnRH以垂体自分泌或旁分泌的方式作用于垂体外组织，调节细胞增殖及凋亡[9]。此外，GnRHA也可直接作用于子宫肌瘤组织，诱导凋亡效应。GnRHA可上调促凋亡蛋白Bax及FasL，降低抗凋亡因子Bcl-2的水平来发挥抗肿瘤效应[10]。此外，GnRHA也可通过抑制Akt及ERK1/2的活性来发挥抗肿瘤效应[11]。

GnRHA药物亮丙瑞林可减少子宫肌瘤患者的子宫体积、肿瘤体积及出血，同时降低雌激素及孕酮水平[12]。但亮丙瑞林长期服用后可伴有较严重的副作用，它可产生短暂的绝经反应且大多数肌瘤会抵抗亮丙瑞林的效应，尽管如此，仍有64%的患者对亮丙瑞林有较强的敏感性。曲普瑞林（triptorelin,TPRL）与亮丙瑞林类似，也是一种GnRHA类药物，但其安全性及对子宫肌瘤的敏感性要优于亮丙瑞林等其他GnRHA类药物[13]。为了为揭示曲普瑞林抑制子宫肌瘤生长的机制，本研究首先检测了心肌素对人源平滑肌瘤细胞的SM22α及α-SMA表达的影响及曲普瑞林对该影响的作用，并分析了曲普瑞林对小鼠皮下成瘤组织中ERα、PR-A及PR-B表达、Caspase-3和Ki67水平的影响。

材料与方法

1 实验动物

雌性胸腺缺失裸鼠（5～6周龄），购自四川省人民医院实验动物研究所[SCXK(川)2018-0015]，饲养于成都大学四川抗菌素工业研究所SPF级实验动物房[SYXK(川)2014-021]，饲养环境相对湿度45%～55%，每天光照12h，饲养1周后进行实验。

2 主要实验试剂

曲普瑞林购买自益普生法国生物技术公司；心肌素（myocardin，MCD）的过表达质粒（pcDNA3.1-MCD）以及对照空载体质粒（pcDNA3.1-vector）由武汉金开瑞生物工程公司合成；胎牛血清（FBS）以及DMEM培养基购买自美国Hyclone公司。青霉素、链霉素和Lipofectamine 3000购买自美国Invitrogen公司。BCA试剂盒购自美国Thermo公司；PVDF膜和ECL发光液购自美国Millipore公司；Alexa Fluor或HRP标记的二抗购买自武汉艾美捷生物科技有限公司；抗孕激素受体A (progesterone receptor A, PR-A)抗体（sc-9685）购买自美国Santa Cruz公司；抗SM22α（ab18735）和雌激素受体α（estrogen receptor α, ERα）抗体（ab23706）购买自美国Abcam公司；抗孕激素受体B （progesterone receptor B，PR-B）（9865）和Caspase-3抗体（4006）购买自美国Cell Signaling Technology公司；抗Ki67抗体（AC-5595）购买自美国Proteintech公司；抗α-SMA抗体（BD5197）购买自美国Bioss公司。

3 细胞培养

选取术中取下的患者子宫肌瘤组织，胰酶消化后的子宫平滑肌瘤细胞生长于含有10% FBS的DMEM培养基中。当细胞处于对数生长期时，使用含有EDTA的0.25% 胰蛋白酶将细胞消化使用培养基重悬后接种于不同器皿中进行后续实验。

4 细胞转染与分组处理

对数生长期的人源子宫平滑肌瘤细胞按照1.0×105细胞/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，更换为无血清的DMEM培养基培养细胞12 h利用Lipofectamine 3000分别辅助转染pcDNA3.1-MCD和pcDNA3.1-vector。然后更换含有10%FBS的DMEM培养基继续培养细胞24h。收集已转染pcDNA3.1-MCD和pcDNA3.1-vector的子宫平滑肌瘤细胞，按照实验目的分为对照组（Con）、心肌素处理组（MCD）和心肌素联合曲普瑞林处理组（MCD+TPRL）。其中对照组采用已转染pcDNA3.1-vector的子宫平滑肌瘤细胞继续培养24h；心肌素处理组采用已转染pcDNA3.1-MCD的子宫平滑肌瘤细胞继续培养24h；心肌素联合曲普瑞林处理组采用20nmol/L曲普瑞林预处理已转染pcDNA3.1-MCD的子宫平滑肌瘤细胞 30min后，再培养细胞24h。

5 免疫荧光检测

取对数生长期的人源子宫平滑肌瘤细胞接种于共聚焦显微镜专用8连孔培养板中，按照上述分组的处理方法进行处理细胞。待细胞处理达到时间终点后，弃培养基，PBS洗涤5min，然后使用4%多聚甲醛在室温下进行固定15min，之后使用PBST洗涤5min 3次。再使用0.1% Triton X-100进行穿孔，并再次洗涤。加入1:2000稀释比例的SM22α抗体，4 ℃孵育过夜。次日孵育结束后，加入1:1000稀释比例的Alexa Fluor标记的二抗在37℃避光孵育1h，然后利用5mg/ml的DAPI试剂在室温避光条件下染细胞核5min。最后，每组细胞在激光共聚焦显微镜随机获得5个视野的细胞荧光染色图像。

6 裸鼠皮下成瘤

皮下成瘤方法：培养ELT-3细胞，以（1.0×107细胞/只）注射入裸鼠背部皮下。2～3周后待瘤组织可见时进行实验。10只裸鼠皮下成瘤后分为两组，分别为对照组（Con）和曲普瑞林干预组（TPRL），每组5只裸鼠。TPRL组腹腔注射曲普瑞林（300 mg/kg/d），每周3次，连续注射4周；对照组注射等量生理盐水。

7 免疫组织化学检测

分离裸鼠皮下瘤组织后，经4%多聚甲醛固定、30%蔗糖脱水、石蜡包埋后制作5μm厚度切片。石蜡切片经枸椽酸钠高温修复，过氧化氢阻断内源性过氧化物酶后，以1:200稀释比例孵育第一抗体（ERα、PR-A、PR-B、Caspase-3和Ki67），4℃过夜；次日，PBS洗涤后用1:500稀释比例HRP标记的二抗孵育1h，之后用DAB显色液染色5min，苏木精复染30s，最后，每组切片的每个染色在倒置显微镜下随机获得5个视野的免疫组化染色图像。

8 Western blot法检测蛋白水平

取经处理的细胞或裸鼠皮下成瘤组织利用RIPA裂解液萃取细胞全蛋白，BCA法测定蛋白浓度并将各组蛋白样品定量至相同浓度后，取15μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，湿转法将蛋白质转移至甲醇预活化的PVDF膜， 100V恒压转膜2h。之后利用5%脱脂牛奶室温下封闭1h，并以1:2000的稀释比例孵育第一抗体（SM22α和α-SMA），4℃过夜。次日，以TBST洗涤后室温孵育1:10000稀释比例的HRP标记的二抗1h，以TBST洗涤后利用ECL法发光，成像仪显影。

9 统计学分析

实验数据均采用均数±标准差表示，并利用SPSS 17.0软件进行后续统计学分析。对于两组定量资料和多组定量资料的比较，数据在满足正态分布和方差齐的条件下，分别采用双侧t检验和单因素方差分析方法。当P＜0.05时，差异被认为具有统计学意义。

结 果

1 曲普瑞林降低人源平滑肌瘤细胞中由心肌素诱导的SM22α和α-SMA上调

SM22α与α-SMA是平滑肌细胞骨架蛋白，其过表达可诱导细胞向平滑肌分化[14]，心肌素可诱导平滑肌细胞的增殖或分化[15]。为了阐明曲普瑞林对人源平滑肌瘤细胞分化的抑制作用，本研究利用心肌素过表达诱导人源平滑肌瘤细胞分化，同时给予曲普瑞林干预，检测曲谱瑞林对平滑肌瘤细胞分化的影响。免疫荧光检测显示，经心肌素诱导后，人源平滑肌瘤细胞SM22α免疫反应性明显上调，而给予曲普瑞林后，与心肌素诱导细胞相比，SM22α免疫反应性明显降低（图1）。Western blot分析显示，经心肌素诱导后，平滑肌瘤细胞SM22α与α-SMA水平显著上调，而给予曲普瑞林后，与心肌素诱导细胞比较组，SM22α与α-SMA水平明显降低。由此提示曲普瑞林可抑制平滑肌瘤细胞的分化。

2 曲普瑞林降低体外成瘤组织ER-α、PR-A及PRB水平

为了阐明曲普瑞林在体内的抑瘤效果，本研究利用ELT-3细胞皮下移植成瘤实验，并给予曲普瑞林干预，结果显示，曲普瑞林干预后，肿瘤组织的体积较对照组相比明显缩小（图3）。对三种性激素受体，ER-α、PR-A及PR-B的免疫组织化学检测显示，经曲普瑞林干预后，这三种受体的水平明显降低（图3）。由此提示曲普瑞林可能通过抑制雌激素受体及孕激素受体来抑制肿瘤生长。

3 曲普瑞林诱导体外成瘤组织细胞凋亡和抑制增殖

为了研究曲普瑞林的抑瘤机制，对体外成瘤组织内Caspase-3及Ki67水平进行了免疫组织化学染色检测，结果显示，曲普瑞林可增高肿瘤组织Caspase-3阳性细胞数并降低Ki67免疫细胞化学阳性细胞数（图4）。

图1 曲普瑞林降低子宫平滑肌瘤细胞内由心肌素诱导的SM22α免疫反应性上调（免疫荧光染色，DAPI复染细胞核）。比例尺，20μmFig. 1 Triptorelin inhibited myocardin-induced increase of SM22α immunoreactivity in the leiomyoma cells (immuno flurescent staining with DAPI counterstain of nuclei). Scale bar, 20μm

图2 曲普瑞林降低平滑肌瘤细胞中由心肌素导致的α-SMA和SM22α水平上调。A, 代表性Western blot检测SM22α和α-SMA水平；B，SM22α水平的统计学分析；C，α-SMA水平的统计学分析；**0.001＜P＜0.01 vs 心肌素处理组；###P＜0.001 vs 对照组；n=3Fig. 2 Triptorelin inhibited myocardin-induced up-regulation of α-SMA and SM22α levels in the leiomyoma cells. A, representative Western blot detection for levels of SM22α and α-SMA; B, statistical analysis for SM22α level; C, statistical analysis for α-SMA level; ** 0.001＜P＜0.01 vs myocardin group. ### P＜0.001 vs control group; n= 3

讨 论

本研究首先利用人源子宫平滑肌瘤细胞，发现曲普瑞林可抑制由心肌素诱导的SM22α及α-SMA表达水平的上调。SM22α与α-SMA是平滑肌细胞骨架蛋白，其在平滑肌的分化过程中具有重要的意义[14]。有研究表明[16]，子宫平滑肌瘤中平滑肌细胞的SM22α与α-SMA表达上调可促进子宫肌瘤的发展，而抑制SM22α与α-SMA可缓解子宫平滑肌瘤的生长分化，与本研究结果一致。因此，曲普瑞林可抑制人源子宫平滑肌瘤细胞的分化及发展。

图3 曲普瑞林对肿瘤生长及肿瘤组织内ER-α、PR-A和PR-B水平的影响。与对照组比较：**0.01＜P＜0.01；*** P＜0.001；n=5；比例尺，100μmFig. 3 Effects of triptorelin on growth of tumors and levels of ER-α, PR-A, and PR-B in tumors. Compared with control group: **0.001＜P＜0.01; ***P＜0.001; n=5; scale bar, 100μm

子宫平滑肌瘤常见于30～50岁女性，而在20岁以下女性中较罕见，其发生常见育龄期，其发生可能与性激素有关[17]。高表达的性激素受体PR-A、PR-B及ERα可以促进子宫平滑肌瘤细胞增殖[18]。为了验证曲普瑞林对体内成瘤的抑制效应，本研究利用大鼠肿瘤来源的ELT-3细胞移植入裸鼠皮下，并给予曲普瑞林干预，结果表明，曲普瑞林可降低瘤组织PR-A、PR-B及ERα的表达水平，诱导细胞凋亡标志性蛋白Caspase-3表达上调及抑制肿瘤增殖标志性蛋白Ki67表达，从而抑制肿瘤组织生长，但具体机制尚不清楚。有研究表明[19]，曲普瑞林可通过抑制MAPK和NF-κB通路活性，从而抑制细胞增殖。另外，曲普瑞林也可通过抑制ERK和钙通道信号通路抑制前列腺癌细胞增殖[20]。

图4 曲普瑞林对体外成瘤组织内Caspase-3和Ki67水平影响的免疫组织化学检测。与对照组比较：**0.01＜P＜0.01；*** P＜0.001；n=5；比例尺，100μmFig. 4 Immunohistochemical examination for effect of triptorelin on levels of Caspase-3 and Ki67 in in subcutaneous tumorigenic tissues. Compared with control group: **0.001＜P＜0.01; *** P＜0.001; n=5; scale bar, 100μm

本研究未进行子宫肌层结构的分析来阐明曲普瑞林对瘤组织与正常子宫肌层的作用差异，也未检测曲普瑞林对正常子宫平滑肌细胞的毒性。子宫壁内的肿瘤微环境，包括生长因子、炎症因子和免疫细胞对GnRHA敏感程度与本研究使用的皮下肿瘤模型可能存在差异，因此，建立有效的肿瘤原位种植方法来阐明曲普瑞林的药效学作用将更有说服力。