实验性脂肪肝出血综合征患鸡生理参数变化

姜锦鹏， 凌 强， 杨亚洲

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

脂肪肝出血综合征(Fatty liver hemorrhagic syndrome，FLHS)，是由于营养障碍、内分泌失调、脂肪代谢紊乱导致肝脏发生脂肪变性并伴有出血为特征的一种营养代谢性疾病[1]。近年来，随着我国养禽业的迅猛发展[2]，集约化养殖规模不断扩大[3]，蛋鸡、肉鸡发生FLHS已变得相当普遍，且呈逐年增多的趋势。病鸡主要表现为肥胖、开产期延迟、产蛋量急剧下降、产蛋高峰维持时间短，有的病鸡因肝功能障碍或肝脏破裂出血而突然死亡，给养殖户造成严重的经济损失，严重危害养禽业的发展[1]。

虽然近年来对鸡脂肪肝出血综合征的研究报道较多，但主要集中于鸡FLHS发病期间血液生化指标、肝脏组织学等方面的变化[4]，而开展FLHS患鸡血压、心率、呼吸频率和心电等生理参数变化的研究甚少。由于该病多呈现散发性，且死前难以诊断，因此，建立其病理模型是开展该病研究的基础[5-6]。陈兴勇等[7]最近研究表明，产蛋鸡血浆雌激素水平明显高于开产前蛋鸡，且在产蛋下降期仍持续增加。陈焱给产蛋高峰期蛋鸡注射雌激素2周后，显著增加了肝脏脂肪含量和肝脏出血指数，FLHS发生率达70%。上述研究说明，高的内源性或外源性雌激素水平可能与鸡FLHS的发生相关[8]。前期试验表明，给未成熟肉仔鸡肌注雌激素，可成功建立鸡FLHS模型[5-6]。因此，本试验根据前期建立的鸡FLHS建模方法，肌肉注射雌激素复制实验性鸡FLHS病例，采用生物信号采集与分析系统描记血压、心电活动，并测定呼吸频率、心率等生理参数，旨在为正确诊断和预防鸡FLHS提供一些参考数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

BL-420F生物信号采集与分析系统，PT-100生物血压传感器，心电图信号输入线均购自四川成都泰盟科技有限公司；TA2004N电子天平(上海精密仪器厂)；三通管，动脉套管，动脉夹，银针，手术剪，眼科剪。苯甲酸雌二醇(纯度99%，上海依赫生物科技有限公司)；肝素钠注射液(1.25万单位/2 mL，天津生物化学制药有限公司)；戊巴比妥钠(纯度99%，上海荣创生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 试验动物与试验日粮 817肉杂鸡购于安徽蚌埠华信禽业有限公司。基础日粮为肉鸡中期配合颗粒饲料(安徽淮北正虹饲料有限公司)，其主要原料组成：玉米、豆粕、进口鱼粉、次粉、磷酸氢钙、食盐、多种维生素、微量元素、氨基酸等。肉鸡中期日粮：粗蛋白质为19.0%，粗纤维为5.5%，粗灰分为7.0%，钙为0.7%～1.2%，总磷为0.55%，食盐为0.2%～0.8%，蛋氨酸为0.40%。

1.2.2 试验设计 29日龄817肉杂鸡96只随机分为对照组及试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组设3个重复，每个重复8只。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肌肉注射苯甲酸雌二醇，剂量分别为 30、300、3 000 μg/kg·bw，对照组肌肉注射相应体积的玉米油，每3天 1次，共4周。试验期间，每2天测量1次呼吸频率。处理4周后描记鸡的心电图、血压等指标。

1.2.3 饲养管理 试验期间，鸡只分笼饲养，每个重复1笼，光照时间为16 h/d，自由采食和饮水，每天定时打扫卫生和消毒，并按常规接种疫苗和驱虫。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 呼吸频率 在鸡处于安静状态时，统计1 min腹部羽毛起伏的次数，即为呼吸频率[9]。每组各测量9只。

1.3.2 血压 采用直接测压法。鸡翅下静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg·bw)将鸡麻醉，麻醉后背位固定，钝性分离股部肌肉，找到股动脉，远心端用丝线结扎，近心端用动脉夹夹住。用眼科剪在结扎处的向心方向作一斜行切口，将灌有肝素-生理盐水的动脉套管插入动脉内，用丝线固定套管。将生物血压传感器与BL-420F外置信号采集盒前置面板上1通道相连，再将动脉插管与生物血压传感器相连，并与装有肝素-生理盐水的注射器通过三通将生物血压传感器腔内和动脉插管内的空气完全排出。观察血压波形，待其稳定10 min后，测量股动脉的收缩压和舒张压。

1.3.3 心电图 鸡翅下静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg·bw)将鸡麻醉，仰卧保定于绝缘的解剖台上。将银针分别插于右翼(相当于肱部)皮下和左右腿(股部外侧)皮下，并将心电图信号输入线按心电导联连接方式与银针连接(即白色、红色、黑色导联线分别与右翼皮下银针和左右腿皮下银针连接)，再将信号输入线与计算机ECG插口连接。电极安放15 min后，打开计算机，由“输入信号”下拉菜单1通道中选定“心电”，调节仪器参数(G：2 mV,T：IS,F：30 Hz，扫描速度：250.0 ms/div)，即可在该通道上记录出标准Ⅱ导联的心电。测量指标与方法如下:

(1)QRS综合波时间：测量QRS波起点与终点之间的时程。

(2)P波时间：测量P波起点与终点之间的时程。

(3)PR段：测量P波终点到QRS波起点之间的时程。

(4)PR间期：测量P波起点到QRS波起点之间的时程。

(5)心率：测量相邻两个心动周期的R-R间期，代入右侧公式计算。心率(次/min)=60/(R1-R2)。

1.3.4 临床表现与剖检特征 试验期间，每天观察并记录鸡的精神状况、食欲、行为表现、外貌特征(如鸡冠颜色)、发病、死亡情况等。并于处理28 d(56日龄)每组随机选择6只鸡，空腹称重后剖检，观察肝脏颜色、出血情况及其它组织器官的变化。分离鸡的心脏、肝脏、腹脂(腹脂肪垫和肌胃外脂肪)并称重。心脏重量称量后，再沿室间沟将心脏分成左右心室，称量左心室重量。按下式计算心脏、肝脏、腹脂相对重以及左心室相对重。

心脏相对重量=心脏湿重(g)/宰前活体重(kg)；

肝脏相对重量=肝脏湿重(g)/宰前活体重(kg)；

腹脂相对重量=腹脂重(g)/宰前活体重(kg)；

左心室相对重量=左心室重(g)/全心重(g)×100%。

肝脏出血程度按照5级划分法[6]，以肝脏出血分数表示。屠宰后，记录肝脏表面的出血点数或出血斑数。1级为没有出血，2级为1～5个出血点或斑，3级为6～15个出血点或斑，4级为16～25个出血点或斑，5级为大于25个出血点(斑)或大出血。3级以上判为FLHS鸡，2～3级之间判为亚临床鸡，2级以下判为正常鸡。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，以“平均值±标准差”表示。差异显著性检验采用独立样本t检验和单因子方差分析(One way ANOVA，LSD)，差异显著性标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 临床表现与剖检特征

试验Ⅲ组在处理10 d后，部分鸡开始出现张口呼吸、嗜睡喜卧等行为变化以及肉髯稍有发白、腹部大而下垂特征。试验Ⅱ组约在处理20 d后出现上述症状。试验期间，试验Ⅰ组、对照组未见上述症状。试验鸡只无死亡。剖检时发现，试验Ⅲ组鸡的皮下及腹腔脂肪过度沉积，肝脏明显肿大、边缘钝而厚、质脆易碎、黄染、切面外翻，用手触摸有明显油腻感，表面可见散在点状或斑状出血点。试验Ⅰ、Ⅱ组的临床症状、剖检特征的变化趋势与试验Ⅲ组相似，但程度稍轻。对照组肝脏颜色呈赤褐色、表面光滑、边缘锐利、包膜完整、质地较紧密、大小正常。

2.2 心脏、肝脏、腹脂相对重量及肝脏出血分数

由表1可见，肌注雌激素28 d后，试验Ⅲ组肝脏相对重量明显增加，与其余3组相比差异均达显著水平(P<0.05)；试验组鸡的肝脏出血程度增加，肝脏出血分数均显著高于对照组，其中试验Ⅲ组与对照组相比，差异极显著(P<0.01)；试验Ⅱ、Ⅲ组腹脂相对重量均明显高于对照组和试验Ⅰ组(P<0.01)；各组心脏相对重量和左心室相对重量无显著差异(P>0.05)。

表1 肝脏出血分数和心脏、肝脏、腹脂相对重量的变化

注：同行数据，肩标没有字母或相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，肩标不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)。下同。

2.3 血压和心率

肌肉注射不同剂量(30、300、3 000 μg/kg·bw)雌激素，使鸡的收缩压、舒张压和心率均呈不同程度的降低(表2)，其中收缩压分别比对照组下降了35.78%(P<0.01)、50.25%(P<0.01)、46.11%(P<0.01)，舒张压分别比对照组下降了52.55%(P<0.05)、55.78%(P<0.01)、49.32%(P<0.05)，心率分别比对照组下降了0.06%(P>0.05)、1.02%(P>0.05)、12.46%(P<0.05)。

表2 血压和心率的变化

2.4 心电活动

2.4.1 QRS综合波时间和P波时间 雌激素处理4周后，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的QRS综合波时间明显变长(图1左)，与对照组和试验Ⅰ组相比较，差异均显著(P<0.05或P<0.01)；试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的P波时间也比对照组明显延长(图1右)。

图1 鸡QRS综合波时间(左图)和P波时间的变化(右图)

2.4.2 PR段时间和PR间期 由图2可以看出，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的PR间期延长(图2右)，其中试验Ⅱ组、试验Ⅲ组达显著水平(P<0.05或P<0.01)，而PR段时间变化不大(图2左)，差异不显著(P>0.05)。

图2 鸡PR段时间(左图)和PR间期的影响(右图)

2.5 呼吸频率变化

由表3可以看出，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组鸡只的呼吸频率与对照组相比未见统计学差异(P>0.05)。

表3 试验期间鸡呼吸频率的变化

3 结论与讨论

鸡FLHS是笼养蛋鸡的一种常见病和多发病。FLHS与体内雌激素水平升高有关，通过注射外源性雌激素可以建立鸡FLHS模型。本次试验结果表明，高剂量(3 000 μg/kg·bw)雌激素处理可使鸡的肝脏出血分数和肝脏重量增加；剖检观察显示典型的FLHS病变，鸡皮下及腹腔脂肪过度沉积，肝脏严重脂肪变性，肝脏明显肿大、边缘钝而厚、质脆易碎、黄染、切面外翻，用手触摸有明显油腻感，表面可见散在点状或斑状出血点，符合鸡FLHS模型判定标准，表明造模成功。

动脉血压的高低受外周阻力、心率、循环血量与血管系统容量比值等因素的影响[10]。血管口径和血液黏度是构成外周阻力的主要因素。崔恒敏等[11]发现，FLHS鸡全血黏度、血浆黏度显著升高。血液黏滞度增高，可能增加外周阻力及心脏负担，使血压升高。但本试验中，雌激素诱导的FLHS鸡的股动脉收缩压和舒张压不仅没有升高，反而下降了。这可能由于雌激素促进血管内皮细胞产生一氧化氮(NO)、降低血浆内皮素-1(ET-1)浓度[12]，并阻滞血管平滑肌细胞的钙离子通道[13]，致使血管扩张，降低外周阻力以及循环血量与血管系统容量比值，从而降低血压。

QRS波群持续时间，代表冲动在心室肌扩布所需要的时间，是对心室内兴奋传导的评价。PR间期代表心房开始去极到心室开始去极的时间间期，是对房室间兴奋传导的评价。P波反映左右两心房的去极化过程，P波时间相当于兴奋在两个心房传导的时间[10]。研究结果表明，雌激素诱导的FLHS患鸡的心率降低，而其QRS综合波时间、PR间期和P波时间均延长，这提示心肌的自律性降低以及兴奋在患鸡两个心房间、房室间和心室内的传导速度减慢。谢水红等[14]通过离体蛙心灌流试验，发现雌二醇对离体蛙心脏具有抑制作用，且随着药物浓度的增加，心肌收缩力和心率减慢。陈丽娜等[15]发现，雌二醇浓度依赖性和时间依赖性延长兔窦房结细胞动作电位时程及3期复极时间、降低窦房结细胞动作电位0期最大去极速率和延长0期去极时间，从而降低心率。这说明一定剂量的雌激素将引起鸡的心率和心肌收缩力下降。另有研究表明，FLHS鸡血浆Ca2+浓度显著升高[16]。Ca2+除了参与心肌细胞的兴奋-收缩耦联，增强心肌收缩力外，还参与心肌细胞的电活动[10]。细胞外钙或血钙浓度升高时，由于Ca2+对钠通道的屏障作用增强，使得Na+内流减少，阈电位上移，膜电位的距离加大，兴奋性降低。同时，高血钙减慢Na+内流，不仅降低心肌细胞的去极化速度，而且上移阈电位水平，均导致兴奋的扩布速度减慢，传导性降低。另外，高血钙导致快反应自律细胞的钠离子内流速度减慢，而钾离子外流速度相对加速，使自动去极化速度降低，即自律性降低。高产家禽，其体内雌激素的含量也相对较高。由其体内高浓度的雌激素诱发的FLHS也降低心肌的传导性与自律性。高血钙水平可能是雌激素诱导的FLHS患鸡心肌传导性与自律性降低的原因之一。

本试验中，虽然试验组呼吸频率与对照组相比未见统计学差异，但高剂量组(试验Ⅲ组)在雌激素肌肉注射10 d后呼吸频率有增加的趋势，同时临床观察也发现部分鸡只张口呼吸，这也提示FLHS鸡的呼吸运动有所加强。这可能由于长期高剂量雌激素使鸡的血液黏度增加，血管扩张，血流缓慢，红细胞数量减少，导致机体缺氧，刺激外周化学感受器，使呼吸运动加强，呼吸频率加快。

综上所述，雌激素诱发的实验性FLHS患鸡的收缩压、舒张压和心率显著降低，QRS综合波时间、P波时间和PR间期明显延长，呼吸频率也有增加的趋势，说明实验性FLHS患鸡的心血管和呼吸系统的生理功能发生了变化。