凯氏定氮法测定羊胎素胶囊的总氮量

邹 丽

（四川省食品药品检验检测院，四川 成都 611731）

羊胎素胶囊为自制保健品，由绵羊及山羊的胎盘采用现代生物技术提取加辅料制成，富含卵磷脂、核黄素、抗坏血酸、蛋白质、红细胞生成素、多肽及氨基酸等多种有效成分，具有促进皮肤细胞生长、补血固本、抗衰老、增活力、提高人体器官免疫力的作用，功效主要有增强免疫[1]、抗氧化[2]、延缓衰老[3]、预防和治疗骨质疏松症[4]及抗辐射、抗肿瘤[5]。目前，其质量控制中仅有关于氨基酸和微量元素含量的测定[6-7]，对总氮的含量测定鲜有报道，不能全面反映羊胎素的成分活性。为了全面控制羊胎素的质量，本研究中选择了总氮量作为含量测定的指标成分，并采用凯氏定氮法测定羊胎素总氮量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DK98-1 型电热水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，40 kHZ，80 W）；500 mL 凯氏烧瓶；漏斗；石棉网；冷凝管；滴定管；氮气球，远红外可控调温电炉（成都市聚电器厂BP1810C 型自动双重纯水蒸馏器（郑州长城科工贸有限公司）；BP211D 型Sartorius 电子天平（十万分之一，德国赛多利斯股份公司）。

1.2 试药

茚三酮、基准无水碳酸钠硫酸钾、硫酸铜（化学纯，成都化学试剂厂）；硫酸、氢氧化钠、无砷锌、硼酸、甲基红、溴甲酚绿等试剂均为分析纯；蒸馏水（自制）；羊胎素胶 囊（自 制，批 号 分 别 为 20170805，20170806，20170807）。

2 方法与结果

2.1 理化鉴别

取本品内容物0.4 g，加水10 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，取滤液2 mL，加茚三酮试液2 ～3 滴，摇匀，沸水浴加热5 min，显蓝色或蓝紫色。

2.2 含量测定

2.2.1 溶液制备

参照2015 年版《中国药典（四部）》通则0704 氮测定法项下第一法（常量法）[8]操作。0.05 mol/L 硫酸滴定液：精密量取硫酸2.7 mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至1 000 mL，摇匀，得质量浓度为0.050 7 mol/L 的硫酸滴定液。40%氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠400 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，即得。2%硼酸溶液：称取硼酸20 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，即得。甲基红-溴甲酚绿混合指示液：取0.1%甲基红的乙醇溶液20 mL，加0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30 mL，摇匀，即得。

2.2.2 消解

取10 粒羊胎素胶囊内容物（批号为20170805），混匀，用滤纸称取约0.4 g，精密称定，连同滤纸置干燥的500 mL 凯氏烧瓶中；依次加入硫酸钾10 g 和硫酸铜粉末0.5 g，再沿瓶壁缓缓加入浓硫酸20 mL；在凯氏烧瓶口放一小漏斗并使凯氏烧瓶成45°倾斜放置，用调温电炉缓缓加热，使溶液的温度保持在沸点以下，等泡沸停止，调至强热至沸腾，待溶液成澄明绿色后，除另有规定外，继续加热30 min，放冷。

2.2.3 蒸馏

沿瓶壁缓缓加水250 mL，轻轻振摇，混匀，放冷，加40%氢氧化钠溶液75 mL，注意沿瓶壁流至瓶底，自成一液层，加锌粒数粒，用氮气球将凯氏烧瓶与冷凝管连接；另取2%硼酸溶液50 mL，置500 mL 锥形瓶中，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10 滴；将冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下，轻轻摆动凯氏烧瓶，使溶液混合均匀，加热蒸馏，至接收液总体积约为250 mL 时，将冷凝管尖端提出液面，使蒸气冲洗约1 min，用水淋洗尖端后停止蒸馏。

2.2.4 滴定

馏出液用硫酸滴定液（浓度为0.050 7 mol/L）滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色，即为滴定终点。用空白试验校正（不加样品，只加试剂，重复上述操作）。每l mL硫酸滴定液（浓度为0.05 mol/L）相当于0.401 mg 的氮。

2.2.5 计算

根据中国药品检验标准操作规程氮测定法[9]测定。总氮量（mg/g）= [（V1-V2）×C/0.05×1.401] /M。其中，V1为滴定时供消耗硫酸滴定液的体积（mL），V2为空白试验中消耗硫酸滴定液的体积（mL），C为硫酸滴定液的浓度（mol/L），M为供试品取样量（g）。

2.2.6 方法学考察

专属性考察：取羊胎素胶囊的阴性对照样品（仅含空白辅料），按总氮量测定方法进行测定，结果阴性对照样品无干扰。

线性关系考察：取羊胎素胶囊（批号为20170805）的内容物适量，按总氮量测定方法测定，以取样量为（X）横坐标、总氮量为（Y）纵坐标绘制标准曲线，得线性方程Y=176.58X-2.8476，r=0.999 2（n=6）。结果表明，羊胎素胶囊取样量在0.119 54 ～1.084 31 g 范围内与总氮量线性关系良好。

重复性试验：取羊胎素胶囊（批号为20170807）的内容物5 份，每份约0.4 g，精密称定，按总氮量测定方法测定，计算总氮量。结果羊胎素胶囊平均总氮量为73.05 mg/g，RSD为0.65% （n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取羊胎素胶囊（批号为20170805，含氮量为70.93 mg/g）的内容物共5 份，每份约0.2 g，精密称定，分别置干燥的500mL 凯氏烧瓶中，再依次精密加硫酸铵0.165 g，按上述试验步骤操作，测定含氮总量，计算回收率。结果见表1。

表1 硫酸铵加样回收试验结果（n=6）

2.2.7 样品含量测定

取3 批羊胎素胶囊内容物各20 粒，按批号混匀，分别取约0.4 g，精密称定，按上述方法测定含量（平行测定2 份）。结果见表2。

表2 3 批样品总氮量测定结果（mg/g，n=2）

3 讨论

凯氏定氮法的原理是将含氮有机物在硫酸及催化剂的作用下，经分解后的有机氮转化为硫酸铵，故加样回收试验的对照物质为硫酸铵。在试验过程中，应注意样品放入凯氏烧瓶中时应避免使其粘附在瓶颈部；消解过程中应均匀转动凯氏烧瓶，避免该样品未消解完全而造成氮损失；保证蒸馏中不能停止加热，防止液体倒吸。

经查阅相关文献，常见的总氮量测定方法不多。严志强等[10]采用紫外分光光度法测定了茶薪菇中总氮的含量，但该方法对分析试验环境、玻璃器皿的洁净度等因素要求较高。韦锋等[11]采用了分散非红外法测定了水中的总氮量，但该方法仅适用于测定水样中的总氮量。王键等[12]采用了近红外光谱分析法测定了复合肥的总氮量。刘丰奎等[13]采用的是气相分子吸收光谱法测定水溶肥中的总氮量。这2 种方法的分析速度快，效率高，但常用于化肥和水质中总氮量的测定，其成本高，在食品与药品中罕有使用。

目前，测定食品及药品中总氮量常用方法仍为凯氏定氮法，操作过程虽烦琐，但对总氮量的测定成本低、普适性较强、应用范围广。特别是近几年来，凯氏定氮法对硝基、偶氮、杂环等类化合物也可得到准确的结果，能用于所有动植物样品的分析[14-17]，迄今仍作为《中国药典》法定的标准检验方法。