仿生提取电感耦合等离子体-质谱法同时测定小儿牛黄清心散中可溶性汞和砷含量

裴海燕，高慧珠，孙密朴，叶盛英，李 丽

（中国人民解放军联勤保障部队第九八三医院药剂科，天津300142）

小儿牛黄清心散是由天麻、胆南星、黄连、赤芍、大黄、朱砂、雄黄等14 味药材组方的中成药，具有清热化痰、镇静止痉的作用，主要用于小儿内热引起的痰喘急惊、四肢抽搐、神志昏迷等症状[1-3]。方中，朱砂可清心镇惊、安神解毒[4-5]，雄黄可解毒杀虫、燥湿祛毒[6-7]，二者联用与该药的药效作用一致。但朱砂的主要化学成分为硫化汞（HgS），此外还有少量的游离汞和可溶性汞盐，如氯化汞、氧化汞等[8-9]。硫化汞化学性质稳定，难溶于盐酸和硝酸，在人体胃中难以吸收，基本均随粪便排除，因此口服硫化汞对人体基本无毒。但朱砂中还有少量氯化汞和可溶性汞盐，具有较大毒性，长期服用会损坏人体肝脏和肾脏，同时对人体中枢神经系统和生殖系统有慢性毒性[10-11]。雄黄的主要成分是硫化砷（As2S2），在人体胃肠道难以吸收，几乎无毒，但药材中含有少量的可溶性砷盐和三氧化二砷（As2O3），是剧毒物质[12-13]。目前，朱砂和雄黄的传统炮制方法均为水飞法，主要是为了减少可溶性的汞（Hg）和砷（As），降低毒性。小儿牛黄清心散现行标准中无对朱砂和雄黄药材的质量控制[1]，只有散剂通则的检查项。本试验中对该制剂中可溶性Hg 和As 的含量测定进行探讨，目前对于Hg 和As 的测定主要有原子吸收光谱法[14-15]、原子荧光法[16]，电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）[17 -18] 法及柱前衍生高效液相色谱法等[19]，参考中国药典和上述文献，建立ICP-MS 法同时测定小儿牛黄清心散中可溶性Hg 和As 的含量，可为控制该药的安全性和有效性，以及对改进其质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与材料

仪器：PerkinElmer Nexlon300x 型电感耦合等离子体质谱仪（美国铂金埃尔默公司）；ETHOS UP A 型微波消解仪（美国Milistone 公司）；SHA-B 型恒温水浴振荡器（常州金坛友联仪器研究所）：Sartorius BP210S 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

试药：小儿牛黄清心散样品（山东广育堂国药有限公司，规格为每袋0.3，批号分别为20181203，20190109，20190201）；汞单元素标准物质[批号为GBW（E）081593，质量浓度为1 000 μg/mL]，砷单元素标准物质（批号为GBW08611 -15105，质量浓度为1 000 μg / mL），金溶液标准物质（批号为GSB 04-1715-2006，质量浓度为1 000 μg / mL）；内标溶液锗（Ge），铋（Bi）（质量浓度为1 000 μg/mL），所有单元素标准溶液和内标溶液均购自国家计量科学研究院。KED 调谐液为仪器自带，购自美国珀金埃尔默公司；65%硝酸为优级纯（美国Merk两合公司）；盐酸、胃蛋白酶（上海国药化学试剂有限公司）；水为超纯水（电阻率≥18.3 MΩ·cm，美国Millipore 超纯水机制备）；液氮为高纯液氮。

人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，摇匀，再加水稀释成1 000 mL，即得。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

ICP-MS 工作参数：RF 射频功率为1 300 W，等离子体气体流量为18 L/min；雾化气流速为0.82 L/min，辅助气体流量为1.5 L/min，采样深度为7.2 mm，样品提升速率为1.0 L/min；液氩压力为0.7 MPa；脉冲电压为780 V；样品冲洗30 s，延迟10 s；调谐模式为碰撞模式KED；数据采集重复测定3 次，测定时As 以Ge 作内标物质，Hg 以Bi 作内标物质进行校正。

2.2 溶液制备

分别精密吸取As 和Hg 2 种单元素的对照品溶液适量，用超纯水稀释成每1 mL 中分别含As 1，5，10，20，40 ng 和含Hg 1，2，4，8，16 ng 的系列标准溶液。分别精密量取内标元素Bi 和Ge 标准溶液（1 000 μg/mL）适量，用超纯水稀释成每1 mL 含Bi 和Ge 0.1 μg/mL 的对照品混合溶液。称取样品（批号为20181203）0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50 mL 人工胃液，于恒温振荡器中37 ℃振荡4 h，振荡频率150 r/min，取出，置离心机上，以4 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2 项下的As 和Hg 2 种元素的混合标准系列溶液，按2.1 项下条件进样分析，内标进样管插入0.1 μg/mL 的内标溶液中，同时按从低到高的质量浓度依次将进样管插入上述2 种元素的混合标准系列溶液中，以3 次读数的平均值为纵坐标（Y）、相对应的进样质量浓度（ng/mL）为横坐标（X）进行线性回归。得线性回归方程分别为Y202Hg=0.0071X+0.004 0，r=0.999 2（n=3）；Y75As=0.012 2X+0.008 1，r=0.999 1（n =3）。结果表明，As 和Hg 进样质量浓度分别在0 ～16 ng/mL 和0 ～40 ng/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2 项下的As 和Hg 2 种元素混合标准系列溶液，分别取其低、中、高3 种不同质量浓度的混合标准系列溶液，按2.1 项下条件测定，每种质量浓度重复测定6 次，记录测量值。结果Hg 元素的RSD分别为4.02%，2.43%，1.13%，As 元素的RSD分别为3.40%，2.42%，1.21% （n=6），RSD均在5%内，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20181203）0.2 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液6 份，按2.1 项下条件测定，每份样品重复测定3 次，分别计算Hg 和As 的含量。结果Hg 和As 的平均含量分别为0.068 6 mg/kg 和0.989 9 mg/kg，RSD分别为3.43%和3.22%（n=3），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181203）0.2 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件分别于0，1，2，4，8，16，24 h 时进样测定，记录测定值。结果Hg 和As 2 个元素的RSD分别为4.04%和2.31%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取样品（批号为20181203）0.1 g，精密称定，共称取6 份，置具塞三角锥形瓶中，精密吸取上述Hg 和As 标准品溶液适量，用水稀释成每1 mL 含Hg 10 ng、As 100 ng 的混合溶液，分别加入上述6 份样品中，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件进行测定，计算回收率和RSD。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取各批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件测定，采用标准曲线法分别计算3 批样品中可溶性Hg 和As 的含量。结果见表2。

表2 各批样品中可溶性Hg 和As 的含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品制备方法

试验前期，对供试品的取样量采用正交试验L9（33）进行了考察。当取样量过大时，测定时需要多步骤地稀释，容易导致误差偏大；样品量过少，当采用人工胃液提取时，可溶性的Hg 含量太低，测量误差大，不易获得准确值。综合考虑，取样量为0.2 g 合适。对供试品的提取时间进行了考察，分别在2，4，8，12，24 h 时进行了测定，结果发现，随时间的延长，样品中可溶性Hg 和As 的含量增大，但当提取时间超过4 h 时，可溶性Hg和As 的含量变化不大。综合考虑人体实际服用药物时间，选择供试品的提取时间为4 h。Hg 具有较强的吸附性，极易附着在仪器的采样锥和矩管上，影响As 的测定，因此在样品中需要加入一定的金元素标准溶液，由于Hg 可与金形成金汞齐，使其溶解，可减少仪器污染，保证测定结果的准确性。

3.2 可溶性Hg 和As 测定

方中朱砂和雄黄2 种药材均含有游离Hg、游离As和可溶性的汞盐和砷盐，毒性较大，不同炮制方法对朱砂和雄黄中可溶性Hg 和As 的含量差异很大，当采用传统的水飞法进行炮制时，可溶性Hg 和As 含量最低；同时，也可除去药材中其他部分重金属及其盐类，大大降低了药材的毒性。目前，朱砂和雄黄的炮制主要采用机械化（球磨机）干法研磨，不仅会使Hg 和As 游离出来，同时也不能除去可溶性Hg 和As，以及其他类重金属，从而导致朱砂和雄黄中毒。孔广英等[12]通过砷盐古蔡氏法测得小儿牛黄清心散中可溶性As 含量为0.1% ～0.2%，与本研究结果基本一致。

3.3 ICP-MS 法的优点

ICP-MS 法同时测定多种元素时具有较高的灵敏度和准确性，且具有一次进样同时测定多个元素的优势，缩短试验时间，仪器的灵敏度最高，减少相互之间的干扰，补偿基体效应。依据质量数相近、电离电位相近的原则选209Bi 作为202Hg、72Ge 作为75As 的内标溶液，从而减少元素的直接干扰。同时，为了保证结果的准确性、试验所用容量瓶和大肚吸管均为聚乙烯塑料材质，并采用20%硝酸浸泡过夜洗净后使用，所有量瓶和大肚吸管均经计量院校准合格后使用。