ORMDL3调控内质网应激在疾病中的研究进展①

李 佳 李 莉

(上海交通大学附属第一人民医院检验医学中心,上海 200080)

2007年Moffatt团队在Nature杂志上首次发表了哮喘的全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)结果，发现ORMDL3基因所在的17q21染色体区与哮喘高度相关，这是ORMDL3作为哮喘相关基因的首次报道，引起世界各国哮喘研究者高度关注[1]。后续十多年研究发现，除哮喘外，ORMDL3及其所在的17q21染色体区与炎症性肠病、肾脏疾病及动脉粥样硬化等炎症相关疾病密切相关[2-5]。功能学研究发现ORMDL3主要调控内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、胞内Ca2+平衡、激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)参与自噬、凋亡等过程[5-7]。但目前功能研究的结论并不一致。虽然GWAS研究为发现疾病致病基因提供了良好的平台，但随后的功能研究对于阐明基因参与疾病的生物学机制更为重要。因此，本文对ORMDL3调控ERS参与疾病的相关研究进展进行综述。

1 ORMDL3概述

ORMDL3基因属于进化保守的ORM基因家族，包括小鼠和人的3个高度同源基因ORMDL 1/2/3，ORMDL3定位于17q21染色体区，与哮喘高度相关，而ORMDL1和ORMDL2分别定位于2q32和12q13.2，未见其与哮喘相关的报道。配对比较人和小鼠ORMDL 1/2/3发现，蛋白结构和氨基酸同源性分别达95%和80%[8]。

ORMDL3编码1个含有153个氨基酸的4次跨膜内质网蛋白，在成人肺和肝脏、肾脏和胰腺等器官中表达，但在骨骼肌、心脏及大脑中未检测到ORMDL3 mRNA表达[8]。ORMDL3目前在过敏性哮喘中研究最多，在参与炎症反应的细胞中表达尤其高，在小鼠和人气道上皮细胞和巨噬细胞中高表达，在T细胞和嗜酸性粒细胞中高表达，而中性粒细胞表达ORMDL2而非ORMDL3[9-11]。

目前ORMDL3蛋白的功能尚不明确。近年研究表明，人ORMDL3转基因小鼠表现出的自发性气道重塑、纤维化、黏液合成、炎症和气道高反应性证实ORMDL3为致病因素[12]。目前ORMDL3在疾病中的功能及机制研究尚处于起步阶段，综合国内外研究进展，ORMDL3通过抑制肌浆/内质网Ca2+ATP酶(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCAs)活性参与内质网介导的Ca2+平衡，并激活ERS[2,5,6,13,14]。此通路是ORMDL3参与疾病发生发展的关键，但其在各种疾病中的作用的研究结果并不一致。

2 ORMDL3调控ERS

2.1内质网及SERCAs 内质网膜系统是细胞加工蛋白质、脂质及贮存Ca2+的主要场所。对于大多数分泌和跨膜蛋白来说,新翻译的未经折叠的蛋白经过富有Ca2+与折叠酶环境的内质网进行初步加工，形成稳定的三级结构是分泌途径的第一步。

内质网作为受调控的Ca2+存储库，对于细胞内Ca2+信号的产生至关重要。内质网上存在Ca2+释放通道(如肌醇三磷酸受体和兰尼碱受体)控制Ca2+从内质网进入细胞质，同时也存在钙泵(如SERCAs)使Ca2+返回内质网。因此，SERCAs活性决定了细胞内Ca2+的动向，影响Ca2+信号形成，有助于维持较低的胞内Ca2+水平。SERCAs还可通过调节用于下一个刺激应答可释放的内质网Ca2+水平影响Ca2+依赖的细胞反应[15,16]。SERCAs在Ca2+稳态中起关键作用，多种与内质网Ca2+失调相关的疾病与SERCAs功能失调相关，如哮喘和阿尔茨海默病[17,18]。

2.2ORMDL3通过SERCAs调节Ca2+稳态激活ERS 在HEK293细胞中分别转染GFP和ORMDL3，通过卡巴胆碱刺激内质网Ca2+释放，发现转染ORMDL3的细胞内质网中Ca2+水平较低，且SERCAs活性较低，胞浆Ca2+清除率下降，免疫染色和免疫共沉淀研究表明，ORMDL3与SERCAs共定位并抑制其功能，致使胞浆Ca2+升高，内质网Ca2+降低，Ca2+稳态失衡进而激活ERS[6]。此结果为ORMDL3与SERCAs直接作用调节SERCAs活性提供了确凿证据。

ERS是重要的细胞自我防御机制，在缺氧、药物、Ca2+稳态失衡等刺激下，内质网功能紊乱，大量错误折叠蛋白质堆积于内质网，促使其启动应急机制，此过程称为ERS，经典应急通路即为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。过表达ORMDL3的人气道上皮细胞研究表明，ORMDL3选择性激活UPR的活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路[13]。Haze等[19]证实ORMDL3表达提高可激活UPR信号通路基因，而siRNA介导的ORMDL3表达下调可减弱UPR。此外，ORMDL3表达提高导致ERS/UPR转导分子eIF2α磷酸化和免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP) mRNA水平升高，提示ORMDL3通过激活ERS，活化UPR通路。

2.3UPR专属通路触发细胞自噬 内质网上存在3种ERS受体：RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(RNA-dependent protein kinase (PKR)-like ER kinase,PERK)、肌醇依赖酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)及活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。静息状态下，3种受体与内质网中含量丰富的分子伴侣GRP78/BiP结合而处于无活性状态。一旦发生ERS并启动UPR，GRP78/BiP 便与上述3种受体解离,转而结合新生的未折叠蛋白，解离的膜受体继而活化专属激活通路：PERK-eIF2α通路、IREl-XBP1s通路及ATF6 通路。上述3条UPR专属通路均可触发细胞自噬，清除错误折叠蛋白、蛋白聚集物及受损细胞器，缓解内质网压力[3,20]。

2016年大隅良典因发现“细胞自噬机制”获得诺贝尔生理学或医学奖。自噬是细胞层面的回收再利用，从形成吞噬体开始级联反应，最终降解并回收细胞成分，完成进化保守的物质周转过程，对细胞的稳态维持和存活具有重要意义[21,22]。多种常见疾病，包括癌症、感染、退行性疾病和自身免疫性疾病中自噬均具有重要作用。炎症、ERS、血脂异常等刺激因素均可引起自噬，而ORMDL3在上述诱因中均发挥作用，因此ORMDL3可能为自噬相关基因。

Yang等[23]通过向拟南芥幼苗液体培养基中加入化学物PBA(4-苯基丁酸钠)或TUDCA(牛磺脱氧胆酸)或过表达BiP蛋白，可减少内质网中未折叠蛋白积累，从而抑制自噬。加入未折叠蛋白苄星青霉素或羧肽酶CPY*则可激活UPR和细胞自噬[23]。炎症性肠病的研究显示，具有高分泌特征的潘氏细胞自噬活性显著增强可平衡高水平的ERS[4]。人内皮细胞株中进行的研究表明，敲除ORMDL3不仅能明显减轻氧化型低密度脂蛋白诱导的自噬，且能明显减轻基础和血清饥饿诱导的自噬[2]。因此，ERS可活化UPR专属通路，触发细胞自噬。

3 ORMDL3调控的ERS在疾病中的作用

3.1过敏性哮喘 ORMDL3被确认为哮喘相关基因已十余年，各研究团队在各类哮喘相关细胞中开展功能研究，但目前尚未定论。Miller等[24]研究ORMDL3在气道上皮细胞中的作用，发现体外过表达ORMDL3可活化UPR ATF6途径，并诱导哮喘相关基因表达，过表达ORMDL3的THP-1人单核细胞可激活UPR ATF6途径；相反，Cantero-Recasens等[6]报道ORMDL3过表达激活PERK通路，但不影响UPR的IRE1通路；而Hsu等[24]研究显示，ORMDL3表达水平变化不影响NF-κB诱导气道上皮细胞产生IL-6和IL-8，通过siRNA沉默ORMDL3对UPR并无影响。以上结果不一致原因可能为实验用细胞系不同，目前对UPR的3条通路虽然研究透彻，但3条通路在不同的细胞中分布不同，UPR反应中同一信号分子在ERS的不同时段发挥的效应不同，增加了ERS 研究的复杂性。

3.2炎症性肠病 肠上皮细胞具有高度分泌性，ERS/UPR在其分泌功能中发挥重要作用。炎症性肠病(IBD)患者的肠上皮细胞通常表现出明显的ERS，表明肠黏膜应激相关炎症可能既是炎症的主要来源，也是其延续的主要原因。目前，GWAS和Meta分析已确定了140多个与IBD相关的多态性位点，主要与IBD发病过程中的3条途径相关：微生物识别、自噬和ERS,Hoefkens等[25]将ORMDL3划分为ERS相关基因。

在肠上皮细胞XBP1缺失的小鼠(XBP1ΔIECmice)中，ERS及细胞凋亡水平升高，杯状细胞及潘氏细胞数量下降，导致宿主防御肽合成减少，对李斯特菌易感性增强。XBP1也被证实可抑制实验性结肠炎相关的癌症，在TLR介导的促炎反应中必不可少[26]。PERK-eIF2α和ATF6通路也与肠炎症相关，表达非磷酸化eIF2α的小鼠模型可导致潘氏细胞功能异常，增强沙门氏菌感染和DSS所致结肠炎的易感性。ATF6α缺陷小鼠表现出ERS增强(BiP、ATF4、CHOP和XBP1水平升高)，从而增强了对DSS所致结肠炎的敏感性[27,28]。总之，ERS/UPR途径在维持肠道稳态方面起重要作用，其破坏与IBD中持续的肠道感染、慢性炎症和免疫反应失调相关。因此，以调节该途径为靶点的治疗策略可能是IBD治疗的突破点。

3.3动脉粥样硬化 脂质引起的慢性炎症在动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用，而ORMDL3在脂质稳态、炎症反应、ERS和UPR中起重要调节作用，研究表明哮喘预示着更高的冠状动脉疾病风险。因此，慢性炎症性疾病间具有遗传重叠的可能性，且有必要探索ORMDL3参与动脉粥样硬化的发病机制。

Liu的团队一直致力于ORMDL3的功能学研究，分别在中国北方和南方人群中首次证实了ORMDL3基因上2个高度连锁不平衡的SNP位点(rs7216389和rs9303277)与动脉粥样硬化的相关性，且在北方人群中证实携带这2个风险等位基因的患者ORMDL3 mRNA表达水平显著升高，功能学研究表明，在内皮细胞中，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)上调ORMDL3表达，体外敲除ORMDL3不仅能明显减轻ox-LDL诱导的自噬，且能明显减轻基础和血清饥饿诱导的自噬[2]。然而，目前ORMDL3通过哪些途径及重要的信号通路或分子调节自噬尚未阐明。

3.4肾脏疾病 近10～15年研究表明，内质网功能对肾脏中的蛋白质稳态至关重要，而ERS是各种肾脏疾病的组成部分，如原发性肾小球肾炎、继发于基因突变的肾小球疾病、糖尿病肾病、急性肾损伤、慢性肾病和肾纤维化。膜性肾病实验模型上的研究证实，UPR被激活，LC3-Ⅱ水平升高[29]。糖尿病肾病小鼠肾皮质中CHOP和活化ATF6水平升高，sXBP1进入细胞核导致易位受损[30]。急性肾损伤中，缺血再灌注可引起肾小管上皮细胞内错误折叠蛋白积累，从而激活UPR，UPR保护缺血再灌注损伤，改善肾功能不全和损伤[31]。慢性肾病中，4-PBA处理可降低TGF-β介导的ERS，促纤维化因子和凋亡标记物增加，减轻ERS，减少肾小管细胞凋亡和纤维化[3]。ERS/UPR在维持肾脏蛋白质平衡中发挥重要作用，使用药物维持ERS正常是在预防或阻止肾脏疾病进展的重要方向。

4 总结

尽管ORMDL3在调节胞内Ca2+平衡、激活ERS/UPR、参与自噬、脂质代谢及炎症反应等功能研究中取得了一定进展，但该基因在疾病中的具体作用机制尚未阐明。目前，关于ORMDL3的研究多数局限于哮喘，其在其他炎症性疾病的详细调控网络有待进一步研究。ORMDL3调控的ERS相关炎症作用途径不仅加深了本课题组对疾病致病机理的理解，也为发展新的治疗方法提供了参考。