外泌体在药物成瘾中的作用研究进展

卢关伊，李 斐，吴 宁，李 锦

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，神经精神药理学北京市重点实验室，北京 100850）

药物成瘾是慢性复发性的脑疾病。精神活性物质如吗啡、甲基苯丙胺、可卡因、酒和烟草等滥用均可导致成瘾。由于药物成瘾的神经生物学机制尚不十分清楚，目前临床上缺乏理想的治疗方法和干预手段，导致成瘾者复吸率居高不下，严重损害身心健康，并成为沉重的社会负担［1］。外泌体是近些年来研究的热点，作为一种新的细胞间交流方式，可调节包括神经系统在内的细胞分化、组织内稳态和组织器官重塑等重要生理过程［2-5］。研究表明，外泌体与中枢神经系统疾病如卒中［2-3，5-6］、脑肿瘤［2-4，7］、脑血管疾病［2-5，8］、精神分裂症［5，9］和神经退行性疾病［2-5，10-11］等的发生发展均密切相关，且在中枢神经系统疾病的诊断［10-14］和治疗［11-13，15-16］中发挥重要作用。但外泌体在药物成瘾中的研究起步较晚，目前研究较少。本文以成瘾性精神活性物质分类，包括阿片类、苯丙胺类、可卡因、酒和烟草等，对外泌体在药物成瘾中的神经生物学机制、潜在治疗手段及诊断候选生物标志物等方面的研究进展进行综述，以期为药物成瘾研究和诊断治疗提供新思路。

1 外泌体概述

1983年，外泌体首次被报道。研究者发现，绵羊网织红细胞在体外成熟过程中，会释放囊泡状结构的小体［17］。1987年，JOHNSTONE等［18］将其命名为“外泌体”。外泌体是细胞外囊泡（extra-cellular vesicles，EV）的重要组成部分，但与其他EV如微囊泡（通过细胞出芽与细胞膜融合后直接脱落形成的囊泡）的形成机制不同。外泌体的形成源于细胞内吞，是细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体、经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外的囊泡［19-20］。此外，外泌体的大小（直径50～150 nm）与其他EV如微囊泡（直径100～1000 nm）和凋亡小体（直径100～5000 nm）存在差异，但由于结构相似，现有方法提取分离得到的外泌体可能混有少量非外泌体性质的小EV［19-20］。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其可携带宿主细胞来源的核酸、蛋白质和脂质等大量生物活性分子，在细胞间通讯中发挥关键调节作用［21-22］。外泌体主要通过以下3种形式进入靶细胞［21-23］：①细胞内吞或直接与靶细胞融合；②外泌体表面配体直接与靶细胞膜表面受体结合；③外泌体表面蛋白经蛋白酶水解后与靶细胞表面受体结合。外泌体这种特异识别靶细胞的功能可以避免被随机传送，通过膜融合特异性转移内含物到特定的靶细胞发挥生物学活性，参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化和肿瘤侵袭等多种生理病理过程［21-24］。

2 外泌体在中枢神经系统疾病中的作用

中枢神经系统内包括神经干细胞、神经元和胶质细胞等几乎所有细胞均可分泌外泌体。外泌体可以作为细胞通讯的信使，参与复杂的细胞间信息交流，以促进神经系统的发育、维持神经细胞的稳态以及调节神经元的功能等［2-6］。在过去10年里，许多研究集中于外泌体内含物生物学活性的探讨，特别是外泌体内含的微 RNA（microRNA，miRNA）［25-26］。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要通过沉默遗传信息的翻译而抑制细胞内蛋白质的功能［27］。外泌体miRNA在中枢神经系统疾病中的作用已被广泛证实。研究表明，外泌体miRNA与脑肿瘤、卒中和神经退行性疾病等的发生发展密切相关［4-12］。

外泌体广泛存在于多种体液中，如血液、脑脊液和尿液等［12，28-29］。外泌体的脂质双层膜结构可增强其内含物的稳定性，且在循环外泌体中可检测到脑组织特异或中枢神经系统疾病特异的蛋白质及miRNA［14，28-29］。鉴于循环外泌体具有无创、稳定、特异性高等优点，其作为诊断的候选生物标志物在神经退行性疾病［10-12，28，30］和脑肿瘤［14，31］等领域都有较好的进展［13，29］。在中枢神经系统疾病治疗中，由于血脑屏障的存在，很多药物无法到达中枢神经系统发挥药效，使得相关疾病缺乏有效的治疗手段［16，29］。外泌体作为一种纳米级别的EV，可穿越血脑屏障，逃避机体免疫反应，不良反应较少，因而具有成为治疗载体的潜力［16，29］。目前，已有研究利用外泌体作为载体携带特定的蛋白［11，16］、miRNA［11-12，15-16］及小干扰RNA［11，16，32］，在治疗神经退行性疾病［11-12，14，30］和卒中［15-16，29］等多种中枢神经系统疾病中均有较好的进展［1，16］。此外，利用干细胞来源的外泌体可保护和再生神经元并增加突触可塑性等，在中枢神经系统疾病的损伤修复中也发挥重要的作用［33-35］。

3 外泌体在成瘾性精神活性物质成瘾中的作用

3.1 阿片类

阿片类精神活性物质既包括非法的毒品如海洛因，又包括合法的处方麻醉性镇痛药物如吗啡和芬太尼等。阿片类药物除具有镇痛、麻醉、止泻和镇咳的药理作用外，同时具有成瘾性和耐受性，滥用后易产生依赖。阿片受体是阿片类物质发挥奖赏作用的起始作用靶点，参与阿片类药物成瘾。因此，通过小干扰RNA干扰阿片受体相关蛋白的翻译，可以干预阿片类药物滥用相关的有害影响。目前，虽尚无关于外泌体直接参与阿片类药物成瘾的相关报道，但有研究者从神经母细胞瘤分泌的外泌体中分离出来let-7家族的miRNA和其他一些被认为可以调节阿片类药物成瘾效应的miRNA分子［36］。已有研究表明，慢性吗啡处理可时间依赖性地上调let-7表达，且下调let-7表达可降低μ亚型阿片受体水平，并减轻小鼠吗啡慢性处理所致的镇痛耐受［37］。以上研究提示，外泌体作为miRNA的载体，可能通过传递miRNA参与阿片类药物的作用。据报道，利用表达神经元特异性膜表面狂犬病毒糖蛋白肽改造后的外泌体，将μ阿片受体小干扰RNA经静脉给药传送至吗啡条件性位置偏爱模型小鼠的中枢神经系统中，通过下调大脑中μ阿片受体表达水平，降低小剂量吗啡引起的小鼠复吸行为［38］，这为治疗吗啡成瘾复发提供一种全新的治疗思路，并提示对外泌体进行改造可能成为一种有效的组织特异性强和低免疫原性的靶向中枢神经系统的传递载体，为药物成瘾提供新的治疗策略。

精神活性物质滥用易导致人类获得性免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染形成艾滋病。研究表明，阿片类物质滥用会加速艾滋病患者的神经损伤［39］。吗啡依赖可引起HIV感染的猴基底神经节miR-29b表达上调，神经保护因子血小板衍生生长因子β（platelet-derived growth factor-β，PDGF-β）表达下调，并加重神经元的损伤［40］。体外实验结果表明，吗啡的这一作用是由外泌体介导的，吗啡可加重HIV反式激活蛋白Tat介导的神经细胞毒性反应［40］。具体来讲，吗啡处理可上调HIV-tat蛋白（HIV密切相关的反式转录激活因子）感染的星形胶质细胞外泌体中miR-29b的表达，且上述外泌体可被神经元细胞内化，引起miR-29b靶蛋白PDGF-β的表达降低，从而导致神经元活性的降低［40］。因此，吗啡可通过调节胶质细胞外泌体miRNA，引起神经元的损伤，但外泌体miRNA是否通过调节神经损伤参与吗啡成瘾还需进一步研究。

3.2 苯丙胺类

以苯丙胺和甲基苯丙胺等为代表的苯丙胺类精神兴奋剂，具有兴奋中枢神经系统的药理作用，可引起严重的中枢神经系统损伤，包括精神异常、急性中毒、依赖和戒断综合征等。目前仅有1篇文献报道采用大鼠甲基苯丙胺条件性位置偏爱模型，发现甲基苯丙胺组大鼠血清外泌体miRNA和海马组织的miRNA均发生差异表达［41］。虽然差异表达的miRNA不尽相同，但KEGG分析显示，血清外泌体miRNA和海马组织miRNA的潜在靶点均涉及谷氨酸能突触可塑性功能的调节。此外，该研究还在血清外泌体及海马中发现与成瘾密切相关的miR-181a等表达上调。SABA等［42］研究发现，小鼠腹腔被动注射苯丙胺5 d后，小鼠海马、伏隔核和中脑腹侧区miR-181a表达显著上调，其中以海马变化最为明显，且海马神经元多巴胺信号的激活可诱导miR-181a表达，miR-181a过度表达可通过负性调节α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体亚单位2（AMPA receptor subunit 2，GluA2）的表达来调节突触功能。因此推测，外泌体可能通过其内含的miRNA分子（如miR-181a）调节谷氨酸能突触可塑性参与甲基苯丙胺成瘾。此外，血清外泌体可反映甲基苯丙胺成瘾病变脑区的miRNA的表达变化，提示其有作为成瘾诊断的候选生物标志物的潜力。另一方面，外泌体作为miRNA在外周与中枢神经系统之间的特定生物载体，可能通过在外周和中枢之间相互传递信息介导着一种持续的相互作用，共同调节苯丙胺类药物成瘾。这些外泌体miRNA及其下游靶基因的变化，为研究苯丙胺类药物成瘾的病理机制提供了新的途径，但还需要进一步研究。

3.3 可卡因

可卡因是从古柯叶中提取的天然的中枢兴奋剂，是西方社会滥用最广泛的毒品之一。在体内，可卡因通过阻断多巴胺转运体的功能，抑制多巴胺的重摄取，导致大脑内多巴胺神经传递持续兴奋，使服用者产生欣快感并成瘾［43］。目前有2项研究发现，可卡因可增加外泌体的释放。研究者收集清醒小鼠脑脊液进行蛋白质谱分析，发现急性可卡因给药可使小鼠脑脊液中外泌体相关的蛋白表达增加［44］。CARONE等［45］研究发现，可卡因处理使胶质母细胞瘤细胞小EV的释放量增加，且外泌体的释放具有时间和浓度依赖性。

目前认为，可卡因可通过降低谷氨酸转运体1（glutamate transporter-1，GLT-1）介导的细胞外谷氨酸重摄取而影响谷氨酸突触可塑性，这与可卡因渴求行为密切相关［46-47］。研究表明，神经元可通过分泌外泌体将miR-124-3p转移至星形胶质细胞，这对维持星形胶质细胞GLT-1蛋白表达至关重要［48］。因此推测，神经元外泌体信号的改变对星形胶质细胞的影响可能在可卡因成瘾中发挥重要作用。采用选择性标记神经元外泌体报告基因小鼠的研究发现，小鼠经可卡因自身给药训练后，伏隔核（nucleus accumbens，NAc）内胶质细胞对神经元外泌体的内化作用显著降低，且这一现象可在消退训练后逆转［49］。上述可卡因自身给药模型不同阶段NAc内神经元外泌体-胶质细胞信号的动态变化，为药物成瘾导致的胶质细胞功能障碍提供新的见解。基于现有文献对外泌体作为miRNA有效载体的支持，可卡因暴露不仅可以增加外泌体的分泌，且可能通过调节神经元外泌体miRNA的释放，影响胶质细胞功能，参与可卡因成瘾的病理过程。

3.4 乙醇

酒现已成为世界范围内被普遍滥用的物质，酒的主要精神活性成分为乙醇，乙醇对中枢神经系统内如谷氨酸、多巴胺和内源性阿片肽等神经传递均有广泛作用，长期过度饮酒可出现酒依赖综合征，即耐受性、戒断症状和冲动性觅酒行为等，且会引起周围和中枢神经系统毒性。研究者采用鼻内给予人干细胞来源的外泌体处理长期乙醇摄入的大鼠，发现其可进入大鼠脑内并减轻乙醇诱导的神经炎症和氧化应激，增加NAc内GLT-1的表达，并可显著抑制大鼠乙醇的摄入及戒断后的复吸［50］。有研究表明，酒精滥用会损伤胶质细胞的功能［51］。CRENSHAW等［52］发现，乙醇不但显著影响小胶质细胞系BV2细胞形态、存活和蛋白表达，还可影响小胶质细胞外泌体的生成及内含蛋白的变化。最近研究发现，乙醇以Toll样受体4依赖的方式增加小鼠原代培养的星形胶质细胞小EV的释放及其炎症相关蛋白（NF-κB-p65、NLRP3、胱天蛋白酶1和白细胞介素1β）及miRNA（如miR-146a，miR-182和miR-200b）的含量；通过miRNA的功能分析发现，变化的miRNA参与炎症通路相关的多种基因的调控［53］。此外，上述星形胶质细胞衍生的小EV可被新生小鼠皮质神经元所内化，通过增加神经元炎症蛋白环氧合酶2和miRNA（如miR-146a）的水平触发神经元凋亡［53］。以上研究表明，胶质细胞外泌体可能通过导致神经元功能障碍和损伤，启动及放大神经元炎症反应与酒精滥用有关，但尚待进一步验证。

目前，关于酒精调节的小EV内含物的变化在非神经元细胞中的作用已被广泛证实［54-55］。酒精滥用除产生依赖外，酒精性肝损伤同样是不可忽视的临床疾病之一［56］。在酒精中毒患者和乙醇暴露的大、小鼠血浆中，均发现小EV释放增加及其药物代谢酶CYP2E1等含量显著升高，且血浆外泌体或小EV中CYP2E1的升高可通过激活凋亡信号通路等促进肝细胞以及肝外细胞如单核细胞等死亡［55，57］。另外，循环外泌体中的miRNA（如miR-27a等）被认为是酒精性肝炎的潜在标志物［58-59］。

乙醇也是一种已知的致畸原，在怀孕期间饮酒会导致胎儿酒精综合征。miRNA在酒精诱导的胎儿发育变化中的潜在作用已被早期的文献所综述［60］。目前研究者采用一种从母体血浆中分离胎儿神经元外泌体的新方法，通过检测外泌体内神经相关蛋白的改变，可在妊娠早期检测到由于孕妇大量饮酒而造成的胎儿神经防御功能的下降［61］，这为妊娠早期无创检测胎儿大脑发育及神经损伤提供了重要参考。综上所述，循环外泌体及其内含物可反映酒精引起的炎症反应以及妊娠早期胎儿大脑的神经发育及损伤，提示循环外泌体具有预测酒精成瘾导致的中枢神经系统功能障碍的生物学标志的潜力。

3.5 烟草

吸烟与多种疾病的发生相关，如呼吸系统疾病、心血管疾病和癌症等。已有大量研究表明，香烟提取物处理可影响外泌体或小EV的分泌及其内含物组成的改变［62-63］。鉴于香烟成分可直接入肺，其在慢性阻塞性肺病和肺癌的病理生理中的重要作用已被证实［64］。烟草作用于大脑的主要成分是尼古丁，可以认为吸烟成瘾的实质就是尼古丁成瘾，目前仅在尼古丁处理的巨噬细胞中发现外泌体miR-21-3p上调，其可能通过靶向磷酸酯酶及张力蛋白同源物，增加血管平滑肌细胞的迁移和增殖，而加速动脉粥样硬化的发展［65］。但目前尚未见尼古丁成瘾与外泌体的相关研究。尼古丁的成瘾性归因于大脑中表达的神经元烟碱型乙酰胆碱受体的激活，特别是在缰核区域［66］。已有研究发现，在小鼠尼古丁自身给药模型中引起缰核区四十多种miRNA的表达发生变化［67］；在另一项研究中，啮齿类动物尼古丁的摄入与miR-542-3p水平下调及烟碱型乙酰胆碱受体β2亚基的表达增强有关［68］。越来越多的研究表明，miRNA介导的烟碱型乙酰胆碱受体表达的升高与尼古丁成瘾有关，尼古丁成瘾引起缰核区miRNA的表达变化是否部分通过外泌体所介导需进一步研究。

4 总结与展望

目前大量研究表明，外泌体参与了中枢神经系统疾病的发生发展及损伤修复过程，但外泌体在药物成瘾中的神经生物学机制及诊断治疗方面的研究还相对不足，属于崭新的领域。初步研究提示，阿片类、苯丙胺类、可卡因、酒和烟草等成瘾性精神活性物质不但可调节外泌体的分泌，还可通过影响细胞间通讯，如通过改变外泌体内miRNA表达及传递而影响神经元炎症、损伤和突触可塑性等，可能在药物成瘾中扮演重要角色。此外，外泌体携带有益于治疗的小干扰RNA可穿过血脑屏障，作为一种强有力的靶向性药物载体，有助于减轻吗啡成瘾复吸。采用外泌体干细胞应用于酒精成瘾的治疗也有一定的进展。另一方面，外泌体因可透过血脑屏障并携带反映中枢神经系统生理病理状态相关的miRNA等活性分子、且能稳定存在于体液中的特点，使神经系统疾病诊断方面的研究进展迅速，但目前尚无关于外泌体作为药物成瘾状态诊断的候选生物标志物的相关文献报道。因此，进一步深入研究外泌体的合成释放及其介导的细胞间信息交流，将有助于阐明药物成瘾的神经生物学机制，为其诊断治疗提供新策略，具有广阔的发展前景。