激光共聚焦检测Notch1和survivin蛋白在人肺腺癌细胞株A549中表达的相关性研究

沈圆兵 方焕

（蚌埠医学院第一附属医院 安徽 蚌埠 233000）

肺癌的发病率有逐年上升的趋势，研究肺癌相关基因对于阐明肺癌发生、发展的机理以及诊断和治疗都有重要意义。Notch1信号通路的异常活化有助于肿瘤的发生发展。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，具有肿瘤表达的特异性，乳腺癌中有研究发现survivin可能是notch1转录调控的直接靶基因[1]，而在肺癌中有关Notchl和survivin表达的相关性研究国内、外鲜有报道。本研究采用免疫荧光双标法检测A549中Notchl和survivin的共表达，并用γ-分泌酶抑制剂DAPT-抑制Notch信号通路作用于A549细胞48h后激光共聚焦检测两者的荧光强度，探讨两者在非小细胞肺癌中发生发展的相关性，为进一步探明肺癌的发病机制提供理论基础和实验数据。

1.资料与方法

1.1 标本及试剂

人肺腺癌A549细胞购自中国上海生命科学院，按常规方法培养。取处于对数生长期的A549细胞，用F-12 HAMS培养基制备成1×104/ml细胞悬液，接种于放置有洁净无菌盖玻片的6孔培养板中。细胞贴壁后加入40umol/L DAPT处理，48h后取出盖玻片，以PBS液洗涤3次，4%多聚甲醛固定15min，自然风干后备用。γ-分泌酶抑制剂购自sigma公司，鼠抗人notch1单克隆抗体购自SantaCruz公司，兔抗人survivin多克隆抗体、DyLightTM488标记山羊抗鼠IgG以及DyLightTM 594标记羊抗兔IgG均购自北京中山生物技术公司。

1.2 细胞双标免疫荧光染色

双标免疫荧光检测参照Bemardini等[1]介绍的方法进行，具体实验过程中的时间、浓度和温度自行摸索，简要步骤如下：4%多聚甲醛固定15min，PBS液漂洗3次×5min，0.5%Triton穿孔20min，PBS液漂洗3次×5min，1%BSA（牛血清白蛋白）封闭30min，倾去，勿洗。将1%BSA稀释的survivin兔抗人多克隆抗体(1∶60)和1%BSA稀释的notch1鼠抗人单克隆抗体按体积比1∶1混匀，一起加到切片上，4℃孵育过夜；PBS充分漂洗后加DyLightTM 488标记羊抗鼠IgG(1∶30)以及DyLightTM 594(1∶40)标记羊抗兔IgG按体积比1∶1混匀，避光操作将其滴加到切片上，37℃孵育箱避光孵育1h；PBS漂洗3次×5min，用甘油封片后，荧光显微镜下预观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 激光共聚焦显微镜观察

利用D-EcliPse-C1型激光共聚焦显微镜观察并摄像，DyLightTM488的激发波长为488nm，DyLightTM 594的激发波长为595nm。notch1阳性表达荧光呈绿色；Survivin阳性表达荧光呈红色；两者共表达则表现为黄色荧光。为定量分析γ-分泌酶抑制剂处理前后两者的荧光强度，选择细胞较为密集的区域，每张切片选取荧光表达最强的10个视野扫描观察并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与面积。荧光值=平均荧光强度x平均荧光面积。该部分实验重复3次，以平均荧光强度作为该蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

Notch1在A549细胞中阳性表达呈绿色荧光；survivin阳性表达呈红色荧光；两者在同一位置共表达呈黄色荧光。γ-分泌酶抑制剂处理前后两者的表达见图1和图2。统计学分析显示γ-分泌酶抑制剂处理后两者的表达较处理前明显减少，P＜0.05，差别具有统计学意义，见表。

图1 γ-分泌酶抑制剂处理前notch1和survivin在A549细胞中的表达

图2 γ-分泌酶抑制剂处理48h后notch1和survivin在A549细胞中的表达

表 γ-分泌酶抑制剂处理前后notch1和survivin在A549细胞中的表达

3.讨论

肺癌是严重危害人类生命健康常见的恶性肿瘤，全球肺癌的发病率和死亡率均居各癌症之首，虽然诊断和治疗水平均有所提高，但肺癌的预后仍然很差，目前总体5年生存率只有16%左右[2]，这与肺癌的发病机制至今未明有关。许多研究表明notch1和肺癌的发生、发展密切相关，γ-分泌酶是notch信号调控的主要介质，DAPT是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，可以特异性阻断Notch信号通路，可抑制notch活性和阻止notch胞内段活性部分NICD的产生，已被证明在抗肿瘤方面具有潜在作用[3]。有研究发现活化的Notch1可上调肿瘤细胞BcL-2和抑制P53的表达而发挥抗凋亡作用[4]，而作为抗凋亡蛋白家族重要成员的survivin于前期研究中发现在肺癌中异常高表达，且Lee等[1]研究发现notch1在乳腺癌中高表达，在MDA-MB-231细胞中notch1活化导致survivin表达增加，notch1基因沉默导致survivin表达下降，且survivin可能是notch1转录调控的直接靶基因，控制有丝分裂和凋亡耐受，而在肺癌中notch1和survivin的相关性研究报道较少，探讨notch1和survivin在肺癌发生发展中的相关性研究对揭示肺癌的发病机制和靶向治疗有着不可估量的前景；本研究通过免疫荧光双标和激光共聚焦观察和分析notch1和survivin在A549细胞中表达的相关性，并用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制notch1的表达，48h后用扫描分析软件测定荧光强度与面积，根据公式计算出荧光强度值，以平均荧光强度作为该蛋白的相对表达量，分析survivin的表达变化。结果发现notch1和survivin在A549细胞质和细胞核同一位置存在共表达，且DAPT处理48h后两者的表达均显著降低（P＜0.01），表明notch1和survivin在NSCLC A549细胞中存在共表达；Lee等[6]研究发现在乳腺癌中存在notch1-survivin信号轴，表明survivin可能是notch1的下游靶基因，前期研究发现HIF-1a参与survivin的表达调控，基因沉默后survivin的表达降低，同时共同参与肺癌裸鼠移植瘤的生长[5]，是否在NSCLC中也存在这一信号轴、HIF-1a是否参与此信号研究是今后我们研究的重点，以此进一步阐明肺癌的发病机制，为肺癌的临床治疗提供更多的实验数据和理论基础。