桑葚色素超声波辅助双水相萃取分离及其抗氧化性

张增帅，董文宾, ，卢军，许先猛，黄健, ，马蓉丽

1. 运城职业技术学院（运城 044000）；2. 陕西科技大学（西安 710021）；3. 汉中市食品药品监督管理局（汉中 723000）；4. 运城学院（运城 044000）

桑椹（Mulberry），俗称桑果，含有维生素、氨基酸、矿物质、酚类、总黄酮等活性成分[1]，具有抑制有害物质的生成、利肝、利尿、治疗痢疾、延缓细胞衰老、增强免疫力、清除自由基等功效[2-3]。2017年国家卫计委最新发布数据显示，桑葚是“药食同源”食品之一。桑葚通体呈现黑紫色或紫红色，红色素含量较丰富，色价高。近年来，合成色素安全性问题严重阻碍了食用色素的发展，天然色素的开发和研究已成为部分研究学者的关注重点[4]。桑椹红色素具有安全性高、着色效果好等优势，被列入食品添加剂使用卫生标准，且作为功能性着色剂在果酒、果汁、饮料、糖果中广泛应用。

桑椹色素属花色苷类色素，主要着色成分为矢车菊-3-葡萄糖苷[2]，桑葚色素具有清除自由基、抗氧化等功效[5]。近些年桑葚色素提取方法研究广泛，溶剂萃取法[6]、大孔树脂吸附法[7]、超声波辅助提取法[8]等研究和应用较为成熟，但国内外鲜有桑葚色素纯化的研究报道。试验综合考虑色素纯化经济性、安全性和可放大性，采用双水相萃取法辅以超声波作用，纯化桑葚色素，并对色素的抗氧化性进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑椹，市售。

丙酮、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、柠檬酸、醋酸、醋酸钠、氯化钾、氢氧化钠、浓盐酸、氯化钾、1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、3, 5-二硝基水杨酸、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、抗坏血酸以及其它化学试剂，均为分析纯。

BS-224型电子天平，德国SARTORIUS公司；TDL-5型离心机，上海安亭科学仪器厂；SHZ-III循环水多用真空泵，上海亚荣生化仪器厂；KQ-250 TDV高频数控超声清洗机，昆山市超声仪器有公司；722型可见分光光度计，752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；TDL-5型离心机，上海安亭科学仪器厂；JB 2-14型磁力搅拌器，上海大普仪器有限公司；PHS-3 C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；HH-Z 2恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；RE-52 AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；101-1 AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桑葚色素提取工艺及桑葚色素萃取制备

桑葚色素提取工艺：取适量桑椹→制浆→准确称取→加入80%酸性乙醇溶液（pH 2.0），搅拌均匀→50℃水浴提取2 h→取上清液，浓缩→醇沉→过滤→浓缩→制得桑葚色素溶液（冷藏备用）。

桑葚色素萃取制备：桑葚色素溶液→超声波辅助双水相萃取→浓缩→冷冻干燥。

1.2.2 桑葚色素测定方法

pH示差测定法[9]：分别取1 mL桑葚色素溶液样品置于两根试管之中，分别加入pH 1.0±0.01的缓冲溶液与pH 4.5的缓冲溶液，静置后得到待测液。平行测定3组，按式（1）和（2）计算桑葚色素浓度。

式中：ε表示矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；DF表示稀释因子；MW表示矢车菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；L表示光程，1 cm。以蒸馏水作为参比，用A700nm来消除样液混浊的影响。

1.2.3 桑葚色素回收率测定

称取适量硫酸铵于离心管中，加水溶解，然后加入适量无水乙醇，最后加入桑葚色素溶液样品，固定体系质量20 g。超声处理后在3 500 r/min条件下离心10 min。记录上下相体积，并测定上下相中色素含量。桑葚色素回收率（Y）按式（3）计算。

式中：VT，VB分别表示上下相体积，mL；CT，CB分别表示上下相桑葚色素的质量浓度，mg/L。

1.2.4 双水相体系的选择

分别选择有机相甲醇、乙醇，盐相硫酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。在离心管中加入等质量的盐相，加水溶解，再加入有机相，观察各自分相状况，并测定不同体系的pH。

1.2.5 桑葚色素萃取条件的单因素试验考察

选取盐浓度、乙醇体积分数、溶液pH、超声功率、超声时间、萃取温度、料液比等单因素进行试验，考察各因素对桑葚色素萃取回收率的影响。

1.2.6 桑葚色素萃取条件的正交试验考察

根据单因素试验，选取硫酸铵质量分数、乙醇体积分数、超声功率和超声时间4个因素进行正交试验，选取3个水平，采用L9(34)设计正交试验进行条件优化。试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平

1.2.7 桑葚色素抗氧化性研究

1.2.7.1 清除1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）能力的测定

取质量浓度为0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，按照许先猛等[10]方法分别测定其对DPPH·清除率，每个样品重复做3次。

1.2.7.2 清除羟自由基（·OH）能力的测定

取质量浓度为0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，测定方法参考刘继攀等[11]的报道，稍作改动。空白管为2.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液和8.0 mL蒸馏水，未损伤管为2.0 mL的磷酸缓冲液、1.0 mL 7.5 mmol/L FeSO4、1.5 mL 5.0 mmol/L邻二氮菲和5.5 mL蒸馏水。损伤管为2.0 mL的磷酸缓冲液、1.0 mL FeSO4、1.5 mL的邻二氮菲、1.0 mL H2O2（0.1%）和4.5 mL蒸馏水。样品管为2.0 mL的磷酸缓冲液、1.0 mL FeSO4、1.5 mL邻二氮菲、1.0 mL样品液、1.0 mL H2O2和3.5 mL蒸馏水。置于恒温水浴锅中，于37 ℃保温60 min，在波长510 nm处测吸光度（A）。按式（4）计算羟自由基（·OH）清除率。

1.2.7.3 清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定

取样质量浓度为0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，测定方法参考胡月芳[12]的报道，稍作改动。取4.5 mL的Tris-HCl缓冲液（pH 8.20，50 mmol/L）于试管中，将试管置于恒温水浴锅中，于25 ℃保温20 min，取出，加入40 μL 25 ℃的邻苯三酚溶液（45 mmol/L，溶剂为10 mmol/L HCl），混匀，在波长420 nm处测定吸光度（A），每隔30 s测定1次。按式（5）计算超氧阴离子（O2-·）清除率。

式中：A0表示邻苯三酚的自氧化速率；A1表示加入样品后的自氧化速率。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系的确定

研究结果表明，乙醇与磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸铵均能形成双水相。乙醇与硫酸铵形成的双水相体系稳定，界面明显，其他双水相体系效果不理想。研究表明[13]，桑椹色素在偏酸性条件下特别是在盐酸溶液中稳定性较好。为保证桑葚色素化学结构稳定和桑葚色素的萃取效果，将乙醇-硫酸铵双水相体系用盐酸调节pH 4.0左右。

2.2 单因素试验结果

单因素试验主要考察了硫酸铵质量分数、乙醇体积分数、溶液pH、超声功率、超声时间、萃取温度、料液比对桑葚色素回收率的影响。

在乙醇体积分数25%、溶液pH 4.0、超声功率200 W、超声时间20 min、萃取温度40 ℃、料液比1︰10 g/mL条件下，硫酸铵质量分数对桑葚色素回收率的影响如图1（a）所示。在硫酸铵质量分数16%～22%范围内，随着硫酸铵质量分数的增大，桑葚色素回收率呈现下降趋势。当硫酸铵质量分数超过22%时，硫酸铵质量分数继续增大，桑葚色素回收率呈现平稳且略有上升的趋势。这是由于硫酸铵质量分数会影响双水相分配系数和体积比，从而导致双水相的两相体积发生较大变化，影响结果[14]。硫酸铵质量分数变大，上相中部分水会分配到下相中，从而使部分色素进入下相，造成桑葚色素损失。

在硫酸铵质量分数16%、溶液pH 4.0、超声功率200 W、超声时间20 min、萃取温度40 ℃、料液比1︰10 g/mL条件下，乙醇体积分数对桑葚色素回收率的影响如图1（b）所示。在乙醇体积分数15%～35%范围内，随着乙醇体积分数的增大，桑葚色素回收率呈现先上升后下降的趋势。这是由于双水相体系中，随着乙醇体积分数的增大，下相中的水会向上相转移，上相体积增大，因此上相中桑葚色素含量增加[15]。但是乙醇体积分数过大会导致下相中有硫酸铵析出，从而影响双水相体系，不利于桑葚色素的分配，降低桑葚色素回收率。

在硫酸铵质量分数16%、乙醇体积分数25%、超声功率200 W、超声时间20 min、萃取温度40 ℃、料液比1︰10 g/mL条件下。溶液pH对桑葚色素回收率的影响如图1（c）所示。在溶液pH在2～6范围内，随着溶液pH的增大，桑葚色素回收率呈现先上升后下降的趋势。桑葚色素在酸性环境中比较稳定，当液pH不断增大，部分桑葚色素结构会被破坏，从而降低桑葚色素回收率[13]。

在硫酸铵质量分数16%、乙醇体积分数25%、溶液pH 4.0、超声时间20 min、萃取温度40 ℃、料液比1︰10 g/mL条件下，超声功率对桑葚色素回收率的影响如图1（d）所示。在超声功率100～500 W范围内，随着超声功率的增大，桑葚色素回收率呈现先上升后下降的趋势。这是由于超声波通过空化作用、机械作用和热效应加速双水相充分分离，提萃取效率[15]。当超声波功率过大时，超声波空化作用过于剧烈会增加双水相中空气，不利于色素在双水相中的分配，从而降低桑葚色素回收率。

在硫酸铵质量分数16%、乙醇体积分数25%、溶液pH 4.0、超声功率200 W、萃取温度40 ℃、料液比1︰10 g/mL条件下，超声时间对桑葚色素回收率的影响如图1（e）所示。在超声时间10～50 min范围内，随着超声时间的延长，桑葚色素回收率呈现先上升后趋于平行的趋势。这是由于适宜功率的超声波加速双水相充分分离，提高桑葚色素回收率。

在硫酸铵质量分数16%、乙醇体积分数25%、溶液pH 4.0、超声功率200 W、超声时间20 min、料液比1︰10 g/mL条件下，萃取温度对桑葚色素回收率的影响如图1（f）所示。在萃取温度30～70 ℃范围内，随着萃取温度的升高，桑葚色素回收率呈现先缓慢上升后缓慢下降的趋势。升高双水相体系温度可以加快分子扩散运动，加速双水相体系充分分离，提高桑葚色素回收率。当温度过高时，部分热敏性色素的结构遭到破坏，这降低了桑葚色素的回收率。

在硫酸铵质量分数16%、乙醇体积分数25%、溶液pH 4.0、超声功率200 W、超声时间20 min、萃取温度40 ℃条件下，料液比对桑葚色素回收率的影响如图1（g）所示。在料液比1︰5～1︰25 g/mL范围内，料液比的变化对萃取效果影响不大。

2.3 正交试验结果

按L9(34)进行正交试验，结果如表2所示。结果显示，影响桑葚色素回收率的因素大小依次为RB＞RC＞RA＞RD，即乙醇体积分数＞超声功率＞硫酸铵质量分数＞超声时间，超声波辅助双水相萃取桑葚色素最佳工艺为A1B2C3D2，即硫酸铵质量分数为16%，乙醇体积分数为25%，超声功率为300 W，超声时间为30 min。按此条件进行验证试验，桑葚色素回收率为80.5%。

2.4 桑葚色素抗氧化性研究

2.4.1 不同样品对1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）清除能力的测定

将不同样品配制成相同浓度（0.10 mg/mL），测定其DPPH·清除能力，结果如图2所示。4种样品对DPPH·均有清除效果，VC对DPPH·的清除效果最好，桑葚色素次之，PG与BHT对DPPH·清除率较低。于哲[17]研究表明，桑葚色素对DPPH·具有一定的清除率，有较好的抗氧化活性，这与此次试验结果一致。

2.4.2 不同样品对羟自由基（·OH）清除能力的测定

将不同样品配制成相同浓度（0.10 mg/mL），测定其羟自由基的清除能力，结果如图3所示。4种物质对·OH均有清除效果，桑葚色素对·OH的清除效果最好，PG次之，VC和BHT对·OH清除率较低。

图1 各因素对桑葚色素回收率影响

表2 正交试验表

图2 对DPPH·的清除效果

图3 对羟自由基的清除效果

将不同样品配制成相同的浓度（0.10 mg/mL），测定其清除超氧阴离子的能力，结果如图4所示。4种物质对O2-·均有清除效果，桑葚色素对O2-·的清除效果最好，BHT次之，PG和VC对O2-·清除率较低。牛天羽等[18]研究表明，当桑葚色素（花色苷）质量浓度为0.1～2.0 mg/mL时，其对O2-·清除率为10%～70%，这与此次试验结果基本一致。

图4 对超氧阴离子的清除效果

3 结论

选用乙醇-硫酸铵双水相体系，pH控制在4.0左右提取桑葚色素，桑葚色素化学结构稳定且桑葚色素萃取效果较好。通过正交试验得出超声波辅助双水相萃取桑葚色素最佳工艺为：硫酸钠浓度16%，乙醇体积分数25%，超声功率300 W，超声时间30 min。按此条件进行验证试验，桑葚色素回收率为80.5%。桑葚色素抗氧化结果表明，桑葚色素对1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、羟自由基（·OH）和超氧阴离子（）均有较好的清除作用，与同浓度的BHT、PG和VC三种试剂相比，桑葚色素具有较强的抗氧化活性。