天然植物抗菌液凝胶膏剂流变学特性及烫伤修复作用研究

杨飘，付鹏德，韦乐华，郝静，向飞丹州，茆灿泉

(1.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031； 2.云南普洱丹州制药股份有限公司，云南 宁洱 665199)

天然植物抗菌液(natural plant antimicrobial solution，PAMs)是云南普洱丹州制药股份有限公司出品的一种多功能酊剂产品，具有抗菌消炎、促进伤口愈合、治疗皮肤溃烂以及抗肿瘤等多种功效[1]。凝胶制剂已经广泛地用于治疗皮肤烧伤和烫伤，具有创面紧密贴合不粘连、减少微生物滋生、药物缓慢释放、延长作用时间、减少用药次数、不污染衣物和方便使用等优点[2-3]。为此，将PAMs与凝胶制剂相结合，可望进一步强化PAMs功效、获得皮肤生物相容性良好、且药物作用时间长的透皮多功效制剂。

凝胶膏剂兼具固体和液体的特性，属于透皮药物传递系统，最早应用于日本[4]。中药材中水溶性药物成分很多，非常适合载入水凝胶基质，是目前研究的热点[5-7]。遗憾的是，现阶段关于水凝胶的配方评价尚缺乏一套完整统一且操作简便、准确的评价方法[8-9]。对于交联型凝胶膏剂的基质来说，流变学参数如复数模量(Complex modulus，G*)、储能模量(Storage modulus，G′，也称弹性模量)、损耗模量(Loss modulus，G″，也称黏性模量)、相位角(Phase angle，δ)可间接反映交联水平。基质的固体特性与G′ 有关，可以使凝胶膏剂拥有更大的内聚力；液体特性与G″有关，可以使基质和皮肤紧密的接触，提高渗透率的同时增强疗效；δ和G*用来表示凝胶膏剂基质的交联程度，从而可较准确地评价凝胶膏剂的稳定性[10]。线性黏弹区(Linear Viscoelastic Region，LVR)可以确定凝胶基质承受压力范围的能力，当应力超过LVR的范围时，复数模量G*明显下降，表明此时其内部结构已经被破坏，稳定性下降[11-12]。目前，关于凝胶膏剂流变学研究的文献报道较少，本文以聚丙烯酸高分子(Viscomate NP-700)为骨架材料制备载药(PAMs)凝胶膏剂，结合它对大鼠烫伤模型的修复程度，初步探究PAMs凝胶膏剂的流变学特性及药效作用[13-14]。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

1.1.1 试药 PAMs:云南普洱丹州制药股份有限公司，2015年获批云南省医院制剂(滇药制字Z20150009)；甘油、EDTA、Viscomate NP-700、酒石酸、无水乙醇、氮酮、丙二醇、薄荷醇、SDS(成都市科龙化工试剂厂)；甘羟铝(梯希爱上海化成工业发展有限公司)。

1.1.2 仪器 AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；AKUP-TV-10爱科超纯水机(振大水处理器材有限公司)；三用恒温水箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；TA DHR-1高级旋转流变仪(美国TA仪器公司)。

1.1.3 动物 14只健康Wistar大鼠，体质量260～280 g，成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2015-030。

1.2 方法

1.2.1 不同温度和处理时间下水凝胶基质的制备 以甘油∶Viscomate NP-700∶甘羟铝∶PAMs∶水∶酒石酸∶氮酮∶丙二醇∶SDS=30∶4∶0.4∶31.7∶27.2∶0.2∶3∶3∶0.5(质量比)制备凝胶基质[15-16]。考虑PAMs酊剂产品的酒精挥发性，设置3种不同的温度和处理时间制备凝胶基质：将新制备的凝胶50 ℃恒温固化24 h后室温25 ℃静置2 d形成凝胶(记为：50 ℃-24 h，样品1)；50 ℃恒温固化6 h后室温25 ℃静置，总固化时间3 d(记为：50 ℃-6 h，样品2)；室温25 ℃，固化3 d，备用(记为：25 ℃-24 h，样品3)。

1.2.2 正交设计优化水凝胶基质 采用L9(34)正交表设计正交试验(见表1)，称取0.4%甘羟铝，EDTA 0、0.2%、0.4%，Viscomate NP-700 4.0%、6.0%、8.0%，分别按顺序分散于30%甘油中，混匀，作为A相；称取酒石酸 0、0.2%、0.4%，促透剂(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)，31.7%PAMs，0.5%SDS，溶于水中，搅拌均匀作为B相。将B相缓慢倒入A相，边加边搅拌，然后倒入直径2.0 cm的圆形模具内，凝胶厚度控制在1.5 mm左右，50 ℃恒温固化24 h后室温25 ℃静置2 d形成凝胶备用。同时根据促透剂的不同，制备3种不含PAMs的空白凝胶对照(分别记为#10、#11、#12)，各成分配比为甘羟铝0.4%、EDTA 0.2%、Viscomate NP-700 6.0%、甘油30%、酒石酸 0.2%、促透剂(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)、31.7%乙醇(50%)、0.5%SDS、水。

表1 L9(34)正交试验设计

Table1L9(34) orthogonal experimental designw/%

水平因素A(NP-700)B(EDTA)C(酒石酸)D(促透剂)14.000氮酮3.0+薄荷醇0.326.00.20.2丙二醇3.0+薄荷醇0.338.00.40.4氮酮3.0+丙二醇3.0

1.2.3 凝胶膏剂基质流变学特性的考察 采用旋转流变仪，在室温(25±0.1) ℃下进行流变学性能的检测，平板夹具直径为20 mm，间距设定1 000 μm，在流变仪动态振荡模式下进行试验，应力(σ)设置在0～500 Pa，频率(f)设为1.0 Hz，检测3种样品的线性黏弹区(LVR)。在LVR区域内，选取固定应力为50.0 Pa，频率设在0.016～16.0 Hz进行扫描，测定各样品的流变学参数G*=[(G′)2+ (G″)2]1/2、G′、G″、δ(Tanδ=G″ /G′)[10]。

1.2.4 大鼠烫伤模型的建立与修复初步观察 14只健康Wistar大鼠饲养于SPF动物房中，自由饮食，适应1周后，称体质量。腹腔注射7.0%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉、固定。向带有刻度的玻璃管(r=8.5 mm)中注入沸水2.0 mL，持续处理背部脱毛皮肤20 s，致深Ⅱ度烫伤，烫伤面积约为2.27 cm2。每只大鼠背部造模2个伤口并用苦味酸标记，随机分为4组，分别为PAMs组、PAMs水凝胶膏剂组、空白凝胶组和阴性处理模型组。每日给药1次，给药前先用生理盐水擦拭伤口。每帖凝胶膏剂0.7 g(含PAMs 31.7%)，等量PAMs 246.6 μL。将制备好的水凝胶膏剂，从模具中取出，置于医用无纺布上，敷贴于大鼠患处，并用胶带十字固定，敷16 h后取下；PAMs滴涂，拍照观察[17]。以上所有试验均重复3次。

2 结果

2.1 不同温度和时间对PAMs凝胶膏剂强度的影响

样品1(50 ℃-24 h)、样品2(50 ℃-6 h)、样品3(25 ℃-24 h)的LVR值分别为1～500、1～188、1～144 Pa，即LVR值排序为样品1>样品2>样品3，见图1。其中，样品3的LVR范围最低，说明在应力范围下体系结构最容易被破坏，更有可能断裂，更不稳定。对于3个不同样品，随着频率的升高，G′值和G″值均呈现上升趋势，且样品1>样品2>样品3，即样品1拥有更大的内聚力和皮肤黏附性，见图2(a)、(b)。在0.016～11 Hz内，Tanδ值排序为样品3>样品2>样品1，即样品1弹性特性占比最大，凝胶固体化性质最突出；11～16 Hz内，样品3>样品1>样品2，即样品3黏性特性占比最大，凝胶液体化性质最突出，见图2(c)。G*值排序为样品1>样品2>样品3，与LVR顺序一致，即样品1交联程度最大。温度升高以及时间延长可导致交联速度增大，见图2(d)。

1200100080060040020001002003004005006000G*/Paσ/Pa50℃-24h50℃-6h25℃-24h

图1不同制备条件下PAMs凝胶膏剂应力与复数模量的关系

Figure1Relationship between stress and complex modulus of PAMs gel paste by different preparation conditions

2.2 不同基质成分对凝胶强度的影响

将正交试验获得的#1～#9号凝胶膏剂从模具中取出，初步感官感受PAMs凝胶膏剂的成型性及强度依次为配方#9、#7、#5、#4、#3、#2、#8、#1、#6，见图3(a)。其中，配方#6、#8 LVR范围小，体系结构容易被破坏和不稳定，见图3(b)。

PAMs凝胶膏剂的内聚强度由大到小依次为配方#9、#8、#5、#7、#4、#1、#2、#3(凝胶6结构不稳定，排除比较)，见图4(a)、(d)G*、G′ 变化。PAMs凝胶膏剂的黏附性由大到小依次为配方#9、#8、#1、#5、#4、#7、#2、#3，见图4(b)G″ 变化。配方#1、#3、#8凝胶液体化性质更明显，#7、#5、#4凝胶固体化性质更明显，随着Viscomate NP-700浓度的升高凝胶强度增大，见图4(c)tanδ变化。

100090080070060050040030050℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24hG'/Paf/Hz250200150100500G″/Pa12001000800600400200G*/Pa0.240.200.160.120.080.04101214161802468tanδ(a)(b)(c)(d)f/Hz101214161802468

a.频率与储能模量的关系； b.频率与损耗模量的关系； c.频率与相位角tan δ的关系； d.频率与复数模量的关系。

a. 9种PAMs凝胶膏剂的表观性状； b. 9种PAMs凝胶膏剂应力与复数模量的关系。

a.频率与储能模量的关系； b.频率与损耗模量的关系； c.频率与相位角tanδ的关系； d.频率与复数模量的关系。

图49种PAMs凝胶膏剂的流变学性能
Figure4Rheological properties of nine PAMs gel paste

2.3 PAMs凝胶膏剂初步药效测定

阴性处理模型组(negative group)的伤口色泽没有变化，周边无翘起痕迹；空白凝胶组(#10，#11，#12)也是如此，2组恢复效果几乎相同，说明含50%乙醇的空白凝胶对烫伤基本没有修复作用。配方#3组痂体边缘翘起，有脱落趋势；#1、#2、#4、#9组第5天痂体边缘翘起；PAMs 组在第4天时右边伤口已有明显恢复趋势，第5天时痂体边缘已经翘起，将要脱落，皮肤上有浅红色恢复痕迹。以上结果表明，PAMs与PAMs凝胶膏剂对烫伤均有较好的修复作用。对比分析后，初步认为修复效果依次为#3、#4、#1、#2、#9、#6、#7、#5、#8(见图5)。

2.4 PAMs凝胶膏剂性能的综合评估

结合PAMs凝胶膏剂表观成型性和黏弹性、动物烫伤试验，对正交试验中9种不同PAMs凝胶膏剂进行打分评价[9](评分标准见表2)，其中考虑综合因素，经验性地将成型性和黏弹性设置权重为30%，动物模型评价为70%。由评分结果(见表3)可知,影响因素C(酒石酸)>因素B(EDTA)>因素A(NP-700)>因素D(促透剂)，最优组合为A1B1C2D3，即NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%，不含EDTA。

图5PAMs凝胶膏剂处理对大鼠烫伤模型伤口愈合的作用
Figure5Wound healing of rats scald model treated with PAMs gel paste

表2 PAMs凝胶膏剂的评分标准Table 2 Scoring standard of PAMs gel paste

3 讨论

相比测定表观黏附力，流变学方法的精确度和可信度更高，实验参数更容易调节和控制，重复性良好[18-20]。参考凝胶膏剂基本成分组成，本研究首先开展了PAMs凝胶膏剂的配方研究，综合LVR、G*、G′、G″及δ流变学指标，发现3种不同温度、时间条件下，50 ℃恒温固化24 h后室温25 ℃静置2 d形成的凝胶 LVR范围、G*值、G″值均最大，即其体系结构最稳定，交联程度最大，说明温度升高、时间延长可能导致交联速度增大，凝胶强度更大。酒石酸既起到调节pH以及Viscomate NP-700分子中羧基的电离作用，还可竞争性地与Al3+发生络合作用，也发挥交联调节剂作用[15-16]。配方#6、#8均不含酒石酸，甘羟铝与Viscomate NP-700交联程度低，其LVR值范围小，体系结构容易被破坏，不稳定，G″值大，黏性大；配方#8相比#6，G*值更大，强度更高，说明EDTA浓度的升高凝胶强度减小。在凝胶形成过程中，调节剂EDTA的浓度越大，与Al3+螯合的程度就越大，甘羟铝与Viscomate NP-700交联程度就会降低，凝胶强度也会随之降低。配方#7无EDTA，甘羟铝与Viscomate NP-700交联程度大，G*、G′ 值大。配方#5相比#4，G*、G′值均更大，说明酒石酸对凝胶强度的影响大于EDTA对凝胶强度的影响。

表3 正交试验评分结果分析Table 3 Analysis of orthogonal score results

通过不同配方凝胶膏剂的表观性状评价以及对大鼠烫伤修复程度的对比观察，可以发现凝胶基质的黏弹性、硬度以及释药性能与凝胶骨架NP-700、交联剂甘羟铝及交联调节剂EDTA及pH调节剂酒石酸的浓度大小存在直接联系，且凝胶强度与释药性能间存在一定的正相关。酒石酸和促透剂对药效的影响较大，其中酒石酸浓度越高可能效果更好，促透剂以氮酮和丙二醇为优。初步确定该PAMs凝胶膏剂的优化基质配方为Viscomate NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%、不含EDTA 。

本研究通过体外、体内共同评价的方法为PAMs凝胶膏剂基质处方的筛选和优化提供了一种思路，同时对于建立凝胶膏剂可行的测量指标和评价体系具有十分重要的参考价值。需要说明的是，尽管本研究采用了表观成型性、流变学特性及对大鼠烫伤修复相结合的方法进行了PAMs凝胶膏剂初步和多维度的筛选和评价，但作为一个新产品的研发，还有大量的研究工作需要开展和完善，包括加大实验的重复数以获得更可靠的数据，及对PAMs凝胶膏剂按《中国药典》进行耐热性、赋形性、黏附性检验以验证本文评价体系的合理性，等等。关于以上方面的进一步研究，以及PAMs凝胶膏剂的实验动物模型修复功效的药物释放、分子作用机制将在今后深入开展和进行。