非洲猪瘟病毒核酸检测存在的问题与分析

文│李静 宗克新（山东省曹县畜牧服务中心） 辛学强（山东省阳谷县畜牧兽医事业发展中心） 侯敬民 姜利 高玉环 宇凌（山东省菏泽市动物疫病预防控制中心）

一、引言

自2018年8月我国辽宁省发生第一起非洲猪瘟疫情以来，我国多省份相继发生非洲猪瘟疫情。为了加强非洲猪瘟的防控，各省强制地市配备了非洲猪瘟检测设备，并紧急培训检测人员，建设了PCR检测室。时间紧检测任务重，有的检测室建设不符合要求，有的检测人员技术不过关、仪器操作不熟练，操作方法不严谨等，不能准确检测出病毒核酸，造成了非洲猪瘟检测比对试验不能一次通过。

二、非洲猪瘟病毒核酸检测可能存在的问题

非洲猪瘟病毒核酸检测可能出现检测结果假阴性和假阳性。

1.检测结果出现错误的原因分析。笔者根据自身从事RT-PCR检测10余年积累的经验，分析检测结果出现假阴性或假阳性的原因有以下3点：

（1）采样不规范。随机采样时不注意仔细观察猪的精神状态，也没有按要求逐头测量体温，因采样任务重，只采集较集中的几头，而没有按要求间隔采集，致使没有采集到可疑猪只，造成采集的样本不含有非洲猪瘟病毒。

（2）检测试剂盒质量有问题。我国非洲猪瘟疫暴发突然，很多厂家一窝蜂似的生产核酸检测试剂，在短时间内迅速获得批准文号，但质量却参差不齐。很多试剂盒不设计提取阳性对照，只设置反应阳性对照，很难验证提取过程是否能提出病毒核酸。笔者曾做过非洲猪瘟的比对试验：省比对实验提供的2个弱阳性样品，一个稀释2倍，另一个不做稀释，提取的病毒DNA模板分别用4种试剂进行扩增，4个试验全部出现阳性对照，证明试验都成立。A试剂结果为2个样品可疑，B试剂只检出未稀释样品可疑，C试剂检测结果为2个样品全阴性，D试剂为进口试剂，检测结果为2个弱阳性。由此可见，部分非洲猪瘟病毒荧光RT-PCR检测试剂盒存在质量问题，极有可能真正的阳性样品检出结果为假阴性，不能科学指导非洲猪瘟疫情的防控。

（3）检测过程存在不符合操作规程的地方。核酸检测是微量操作，要求极为严格。首先，人员问题。临时培训的非洲猪瘟病毒核酸检测人员，不能正确熟练地使用微量移液枪，不懂得加液时一档进二档出，枪头外黏带的一个液滴就会超过2微升，这样配制出来的扩增体系误差太大，阳性对照跑不出来曲线，造成试验不成立，阳性样品更不会扩增出阳性曲线。这样既浪费了试剂，又延误了检测结果上报时间，不利于疫情防控。其次，微量移液枪使用问题。县级兽医实验室大多存在经费紧张的问题，检测用的耗材不能足量配备，在做试验时操作不规范，移液枪与枪头不相配造成配液加样误差大：如果反应液为18微升，RNA模板为2微升，选用20微升的移液枪却用200微升的枪头，这样配制的反应体系肯定不是20微升，从而出现假阴性结果。再次，配制反应体系不严谨。试剂标注量不一定精确，每次使用都应精密量取，而不应该认为大差不差就行。有的检测人员在配制反应体系时，不用移液枪量取试剂，不按照试剂瓶标注的量进行配制，造成扩增反应体系有很大偏差。最后，常温操作时间过长。任何PCR检测的反应体系，在常温下保存时间过长都容易失效。提取仪大多是32份或是36份的，提取96份样品集中扩增要分3次提取，增加了操作时长；另外，反应体系配制过早，且分装速度慢，提取的RNA模板和反应体系如果常温放置时间过长都会造成假阴性出现。

2.检测结果出现假阳性的原因分析。通过生物安全大检查发现，以下原因可能产生假阳性：

（1）实验室功能分区设计有问题。由于我国非洲猪瘟疫情影响面积大，很多县级动物疫病预防控制中心原来没有分子生物学检测室，由于受场地和财政资金的限制，临时快速建设的RT-PCR实验室，个别实验室不符合非洲猪瘟病毒核酸检测要求。按分子生物学检测要求，PCR检测实验室至少分为配液室、核酸提取室、核酸扩增室，每个室都应有独立的缓冲区，且配液室与核酸提取室之间应设置传递窗，核酸提取室与核酸扩增室不能设置传递窗。

个别实验室只有2个功能检测室，即配液与提取在一个房间内进行，RNA扩增在一个房间进行。往提取试剂盒中加样品和配制反应体系在同一个生物安全柜内进行，很可能给非洲猪瘟病毒核酸扩增体系的配制造成污染，使被检测样品成为假阳性。

有的实验室有3个功能分区，但是各自没有设置独立的缓冲空间，导致PCR实验室与公共走廊没有形成有效隔离，这样也有可能使扩增室的高浓度核酸片段以气溶胶的形式进入配液室和核酸提取室，造成样品污染，出现假阳性。另外，这样还极有可能使病毒外散，不利于疫情防控。

有的实验室虽然有3个功能分区，也有独立的缓冲间，但是样品提取与加提取后的模板在同一个生物安全柜内同时进行，这样极可能使样品交叉污染，使检测结果不准确。

（2）检测人员的影响。有些实验室因为检测人员数量少，检测人员未严格按照“样品准备区→核酸提取区→核酸扩增区”的顺序定向移动，往往穿着同一套工作服在核酸提取室提取完样品接着到配液室配液，又到核酸提取室加提取的RNA模板，然后再到核酸扩增室到上机扩增，再接着到核酸提取区室提取下一波样品。如此反复，造成人为核酸污染。

非洲猪瘟病毒在我国大面积流行，特别是在经济欠发达以畜牧业为主要经济来源的地区，疫情防控更严峻，检测任务更繁重。大量的非洲猪瘟病毒核酸检测，但却没有专业的从业人员，不少地方现抓人员临时培训上场，这些人员在短时间内操作不规范也不熟练，不管是样品核酸提取环节，还是扩增体系配制环节，如果微量移液枪操作不当，容易使移液枪与不同试剂和样品之间发生交叉污染。有的检测人员在试验时移液枪头掉在生物安全柜台面上不丢弃，而继续使用；有的八联排管盖不倒置或是不小心将八联排管盖掉落在地板上再捡起来用；还有的在加样时忘记更换枪头。放置样品或模板时，由于密封不严而溢于容器外，造成不同样品或不同模板间产生交叉污染；有的是加好反应体系及样品RNA模板后，八联排管盖不能一次按顺序对应封闭或是封闭不严密，模板之间互相污染。这些都会造成检测结果错误，导致检测结果可能出现假阳性，导致健康的猪群被错杀，给养殖户造成了巨大的经济损失。

（3）样品前处理的影响。因非洲猪瘟病毒存在较强的传染性，且存活时间较长，因此按照操作规范，样品在从样品保存箱取出时应对保存箱内外及样品外包装喷洒乙醇进行消毒，然后在水浴中60℃灭活30分钟。但实际操作中，样品检测量极大，为了节约时间快速出结果，有的实验人员不对样品外包装进行乙醇消毒及灭活。这样就会污染检测环境，极有可能造成样品间的交叉污染造成假阳性结果出现。

（4）试验后消毒不彻底。每一波试验结束后，不对操作台、移液器、生物安全柜、提取仪等进行有效清洁和消毒，导致这些仪器设备表面残留样品污物及核酸片段，给下波试验造成潜在污染隐患，使检测结果出现假阳性。

三、改进的措施及建议

1.国家兽药监管部门和中国动物疫病预防控制中心规定非洲猪瘟病毒核酸试剂必须设置提取阴阳性对照品，并加大对所有试剂产品的抽检力度。提取阴阳性对照品可以验证提取过程及配液过程是否有误，因此必须设置。国家兽药监管部门在对非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒进行抽检时，应对各个厂家的产品进行比对，验证各个厂家的试剂盒是否能检出非洲猪瘟病毒核酸弱阳性样品，筛选出合格产品，对不合格产品的厂家责令限期整改。

2.实验室严格分区。病毒核酸检测实验室，必须严格按P2实验室的具体要求设计建设，将实验室严格分隔成配液室、核酸提取室、核酸扩增室3个完全独立的功能室，做到对互不相容活动的相邻试验区域形成真正有效的隔离，设置传递窗口，并安装紫外灯，防止交叉污染的发生。

3.省级动物疫病预防控制中心对市县级疫控中心加强指导。

（1）规范非洲猪瘟病毒采样工作。采样人员在采样前采取措施挑选出体温升高和精神沉郁的猪只，采集血液，屠宰场在屠宰生猪时每一批都应采集血槽血。

（2）省级动物疫病预防控制中心指导市县两级疫病预防控制中心加强对非洲猪瘟病毒核酸检测人员的培训。用于非洲猪瘟病毒核酸检测的主要方法是荧光PCR。与其他检测方法比较，该方法灵敏性高、特异性强，便于快速检测。由于县级以下以及部分屠宰场兽医实验室过去较少使用荧光PCR等分子生物学方法开展大规模病原学检测，还须进一步加强培训和实际操作，使其进一步熟练掌握该检测方法。培训要求检测人员严格按操作规程对样品外包装进行消毒，并于60℃水浴锅或金浴锅灭活30分钟。

检测人员应熟知微量移液枪的注意事项，配液加样时精确操作，一档进二档出，枪头外不得黏附液滴，取用20微升以下的液体应用20微升以下的移液枪，并应用与之相配的20微升枪头。为防止常温放置时间过长造成核酸模板失活，应将已提取的模板盖封板膜4℃保存。反应体系分装及加模板时，八联排管下应放置冰盒，并在加RNA模板时最好使用1～10微升量程的8道移液枪，尽量减少操作时间。同时，人员不能乱窜，应该通过传递窗传递样品，传递时注意相通的窗门不能同时打开。每次试验前后用75%乙醇或配制好的氢氧化钠消毒液擦拭工作台面以及可能接触到核酸的冰箱、门、窗等把手处、仪器设备，再用紫外线照射整个实验工作区域，不少于30分钟。试验产生的废弃枪头、EP管等废弃物应置氢氧化钠消毒液中浸泡12小时以上，在试验结束后将所有废弃物装入高压袋内密闭121℃高压蒸汽灭菌30分钟，避免污染环境。