牛源ATG13的克隆表达及功能分析

王悦萦，李方琳，粟雨芯，李凌浩，马忠仁

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

细胞自噬与凋亡同时参与细胞损伤时的应激反应，并受到严格的基因层面的调控[1-3]。自噬相关蛋白不仅可以参与自噬的重要功能来调控病毒的入侵，而且还能作用于天然免疫信号通路来调控病毒的入侵及复制，而自噬小体从形成到降解的整个过程中是ATG蛋白的直接参与和调控[4-6]。

ATG是一组进化保守的基因，参与自噬过程中细胞质到液泡的运输过程[7]。Atg13最初作为一种结构性表达蛋白在酵母中被发现，该蛋白在基因层面与 Atg1 相连，后者是自噬所需的一种蛋白激酶。自噬过程需要 Atg1 与 Atg13 之间的直接结合。由于ATG13蛋白在细胞自噬的起始阶段起关键的作用，所以本研究选取了牛的autophagy related gene 13（ATG13）为研究对象[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 感受态细胞DH5α、牛肾细胞（Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK）由西北民族大学生物医学研究中心保存、原核表达菌株 BL21 (DE3)为北京全式金生物技术有限公司产品；pGEX-6P-1质粒由西北民族大学生物医学研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 2×Ex Taq Master Mix、DL2000、T4 ligase；Blueplus II Protein Marker；IPTG 、GST标签抗体、山羊抗小鼠抗体，购自sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 从Genbank中找到ATG13全基因序列，使用Primer Primer 5.0软件设计引物，用于扩增ATG13的编码基因。引物序列如下：

ATG13-BamHI-F：5′ -CGGGATCCATGG AAACTGATCTTAATTCCCAGGACA-3′

ATG13-XhoI-R：5′-CCCTCGAGTTACTG CAGGGTTTCTACAAAGGCA-3′

该引物扩增的目的片段长度为1 440 bp。

1.2.2 ATG13的编码基因的扩增与克隆 由MDBK细胞中获取ATG13编码基因，PCR扩增基因。使用One Step RT-PCR Kit Ver.2进行扩增。琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的基因片段。

1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定 BamHI和Xho I双酶切ATG13基因片段和pGEX-6P-1；琼脂糖凝胶电泳并回收目的基因和线性化的pGEX-6P-1载体。将回收的ATG13基因片段与线性化的pGEX-6P-1载体用T4连接酶于16℃过夜连接。将连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆菌落放大培养，BamHI和Xho I双酶切鉴定并命名为pGEX-6P-1-ATG13，-20℃保存，备用。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达及鉴定 鉴定为阳性的重组表达载体命名为pGEX-6P-1-ATG13，将其转化表达菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆，过夜培养后转接到10 ml新鲜LB培养液中，继续培养至对数期，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导目的基因表达，在诱导后的不同时间点收集菌体，进行SDS-PAGE分析。收集诱导后菌体，经超声破碎后，取上清液进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重组蛋白的Western blot分析 将表达产物进行SDS-PAGE电泳后转膜，5% BSA封闭2 h，与稀释于5% BSA 的ATG13单抗4℃过夜孵育，TBST洗膜。再与稀释于5% BSA的辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG室温下孵育2 h，TBST洗涤后，使用化学发光液进行化学发光。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果及重组原核表达载体的鉴定

经 PCR扩增得到的目的片段大小约1 440 bp，与预期大小相符（图1）。重组质粒pGEX-6P-1-ATG13经BamHI和 Xho I双酶切，电泳后出现1 440 bp的目的条带，证明重组表达构建结果成功（图2）。

图1 ATG13基因的扩增

图2 ATG13重组质粒的双酶切验证

2.2 重组蛋白的Western blot分析

将pGEX-6P-1-ATG13转化至感受态细胞中并制成SDS样品。对融合蛋白进行鉴定，使用考马斯亮蓝染色发现：pGEX-6P-1空载体标签表达蛋白约25kD大小。pGEX-6P-1-ATG13质粒融合ATG13蛋白和GST标签蛋白大小约78kD左右，并且随着诱导时间的延长，蛋白表达量逐渐增加（如图3所示）。之后进行转膜，分别使用一抗ATG13单抗和羊抗兔二抗进行孵育，用化学发光系统发光后在相对分子质量大约78kD位置有目标条带（图4）。Western blot结果显示，重组融合了GST标签的ATG13蛋白正常表达且大小为78kD左右。

图3 ATG13的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

图4 ATG13的Western blot分析

3 讨论

细胞自噬（Autophagy）是细胞在自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[9-11]。

在大多数宿主中，当营养缺乏时或其他外因或内因均可诱导自噬产生。自噬途径的激活依赖于ULK复合体，该复合体是细胞自噬网络中的一个重要的节点[12]。众多的研究表明，ATG13蛋白是组成ULK复合体的重要亚基，本研究显示ATG13蛋白的大小为53KD，在自噬过程中发挥重要的生理功能，是自噬研究的重要环节。随着研究的深入，研究者发现ATG13蛋白除了启动自噬过程外，还参与了细胞其他重要的生理过程，如基因修复、蛋白逆转运、细胞凋亡以及免疫应答等，具体过程还需做更深层次的研究[13-14]。