无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻研究进展

王佳慧 综述 陆金春 梁元姣 审校

东南大学医学院/东南大学附属中大医院生殖医学中心（江苏南京 210037）

精子冷冻保存技术已经广泛应用于人类辅助生殖。近十余年来，国内外学者开始探索无冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻，并获得了一定的成功[1]。多项研究资料显示[2]，使用无冷冻保护剂的玻璃化冷冻正常精液标本可取得与常规慢速冷冻相同的临床效果。但在这些报道的无冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻研究中，实际上均存在一些非渗透性的冷冻保护剂，而所谓的无冷冻保护剂是指无渗透性冷冻保护剂。本文将对无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻的可行性、具体实施方法、面临的问题及可能的应对策略进行综述，以期为未来临床常规开展无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻技术提供指导。

一、无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻的可行性

玻璃化冷冻是指细胞及其保护剂溶液在足够高的降温速率下，由液相直接转变成玻璃状的固体状态，并以这种玻璃态在低温下长期贮存的技术。在玻璃化的过程中，无冰晶形成，避免了冰晶对细胞的物理及化学损伤，有效保留了细胞的生物活性与基本功能，可获得较传统慢速冷冻方法更好的冷冻效果[3]。理论上，玻璃化冷冻相比于传统的慢速冷冻方法，操作更为简便、耗时更短、费用更低、冻融效果更好、精子存活率更高。然而，由于玻璃化冷冻一般使用了高浓度冷冻保护剂，包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂[4]，而渗透性冷冻保护剂具有很强的细胞毒性，同时人类精子对渗透性冷冻保护剂毒性又极其敏感，使得玻璃化冷冻融解后的精子存活率和活动率均显著降低[5]。

渗透性冷冻保护剂也称为膜内保护剂，常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇等，均为小分子化合物。这类保护剂能够自由通过细胞膜进入到细胞内，提高细胞内液体的粘滞系数和溶质浓度，从而抑制细胞内冰晶的产生，减轻冷冻及复温过程中细胞皱缩和渗透性肿胀，但同时对细胞的结构和功能造成明显损伤。甘油不仅会影响细胞微管和微丝的组成和功能，损伤精子细胞骨架，而且能使蛋白质变性、肌动蛋白相互作用及破坏精子线粒体及质膜完整性，甚至对受精后胚胎的发展产生不利影响，并且甘油量添加过高时，精子的顶体膜结构会受到损伤，导致解冻后精子的受精能力下降[6]；DMSO是一种含硫有机化合物，毒性较高，不仅会与蛋白质发生不可逆结合，而且易导致果糖-1，6-二磷酸酶的活性丧失[7]；乙二醇易致精子尾部畸形等[8]。此外，复温时，精子对水的渗透性高于渗透性冷冻保护剂，在渗透性冷冻保护剂尚未完全渗出细胞外的情况下，大量水的进入可引起精子顶体过度膨胀、破裂，造成精子渗透性休克[9]。

那么，无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻是否可行？这是大家所关心的关键问题。精子是可以相对容易实现无渗透性冷冻保护剂的玻璃化冷冻的细胞，这是由其自身特点所决定的。与卵母细胞或胚胎相比，精子中的一些大分子结构如DNA、组蛋白、透明质酸酶的含量更高，可达胚胎的6-8倍[10]，且含水量较低，这就大大提高了精子内胞质液体粘滞系数，同时精子的头部相对较小，冷冻稳定性好，使得在无渗透性冷冻保护剂，但降温速率足够高的情况下，精子形成玻璃样固体状态成为可能。有间接证据表明[11]，精子细胞内成分可以起到天然冷冻保护剂的作用，所有物种中渗透性最弱的小鼠精子可以在仅有非渗透性冷冻保护剂而没有渗透性冷冻保护剂的情况下成功冷冻。另一方面，冷冻过程中的降温速率与细胞内冰晶形成直接相关。如果降温速率极快，精子可迅速达到一种介于液态与固态之间、非晶体、透明的玻璃态，这不仅可保留细胞内外正常的离子分布，而且可避免冰晶形成对精子细胞膜和细胞骨架的物理损伤。研究显示[12]，玻璃化冷冻过程中，冷冻速度越快，实现玻璃化冷冻所需要的渗透性冷冻保护剂的浓度越低。因此，当精子冷冻速度达到一定程度时，无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻就可实现。

据此可知，要实现无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻，精子细胞内较高的液体粘滞系数是基础，而更高的降温速率是保证。

二、无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻的具体实施方法

要成功实施无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻，降温速率要足够快，且要保证所有精子均快速进入玻璃态，最好的方法就是：1.改变冷冻方式，采用快速降温程序；2.改变冷冻载体，使液体样本体积更小，而液体表面积/体积比更大；3.在冷冻保护液中添加合适的组分，以更好地保护精子免受损伤。

（一）冷冻方式的改变

目前精子玻璃化冷冻方式主要有，直接将精子样本投入液氮中和经液氮熏蒸后再投入液氮中。丁露等[13]使用改良麦管法和冻存管法比较了液氮熏蒸和不经液氮熏蒸的精子玻璃化冷冻复苏效果，发现前者的精子复苏率和活动率显著高于后者(P<0.05)。这可能与精子样本直接投入液氮时，液氮被加热引起沸腾产生氮气有关，因为此时产生的氮蒸汽将围绕精子细胞形成一层蒸汽薄膜将精子与液氮隔离,从而减慢了温度的传递速度,降低了冷冻速率。而经液氮熏蒸后，精子样本已被大大降温，再浸入液氮时可避免液氮沸腾，从而避免蒸汽薄膜在精子细胞表面形成。理论上,要获得更高的冷冻速率最好是经液体导热而不是蒸汽,液体的热传导要比蒸汽快得多。

（二）冷冻载体的选择

降低液体样本体积和增大表面积/体积比，主要通过冷冻载体来实现。理论上，只要我们能找到承载样本量最少、表面积与体积比最大的载体，就可以通过超快的冷却速率实现无冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻。根据精子是否与液氮直接接触，冷冻载体可分为开放性载体和封闭性载体。目前报道的开放性载体主要有冷冻环、冷冻薄膜、微滴载体等，而封闭性载体主要有封闭式薄片、一些新发明的载体等。就冷冻效果而言，开放性载体的降温效果更好，但会存在污染风险。如果确保液氮内或冷冻容器表面无菌，可选用开放性载体。

运用冷冻环和冷冻薄膜的表面张力，可将精子附着在环或膜的表面。将其直接投入到液氮中时，可使降温速率从传统麦管的2500℃/min提高到20000℃/min，易于实现玻璃化。研究发现[14]，采用冷冻环进行无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻，在降低冷冻损伤和缩短耗时方面有着常规慢速冷冻法难以实现的优点，且复温后精子染色质的凝聚和DNA完整性与新鲜精子相当。微滴载体冷冻精子样本的体积稍大于冷冻环，研究表明[15]，微滴法可以替代常规慢速冷冻管法冷冻附睾微量精子，在没有明显增加精子核DNA损伤的同时能回收较多可利用的精子。

马超等[16]采用封闭式薄片为载体，发现有、无渗透性冷冻保护剂玻璃化冷冻的人类精子解冻后，精子回收率、活动率及存活率均无统计学差异，从而证实添加渗透性冷冻保护剂并不能改变解冻后的精子相关指标。罗树伟等[17]通过对普通胚胎冷冻麦管进行改造（下端3cm区域采用细砂纸将外侧面打磨粗糙，并将麦管打磨区域沿麦管轴线剪一1/8圆周的细缝，然后选择大小合适的输液针套将麦管打磨区域套住）后，制备了一种新型无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻载体。与开放性精子载体相比，冷冻前后精子存活率及活力无明显差异，但液体承载量明显增加 （从1μl增加至5μl）。 另外，空透明带、电镜铜网(EMG)、微麦管、ICSI针、极体活检针、Cryoleaf、Cell Sleeper、Cryopiece 等，理论上也可进行无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻，但相关报道较少。

（三）冷冻稀释液的改善

为了进一步提高冷冻复苏后的精子质量，尽可能保护精子避免冷冻损伤，许多研究者尝试在精子冷冻稀释液中添加一些组分，其中以抗氧化剂、避免精子膜损伤的物质最常见。通过在冷冻稀释液中添加某些组分以改善冷冻复苏后精子活动率、保护精子正常受精率是目前精子冷冻保存的研究热点之一。

除了在冷冻稀释液中添加一般的非渗透性冷冻保护剂如卵黄、白蛋白、蔗糖或海藻糖等外，海带多糖、枸杞多糖、红景天多糖、益母草多糖、绞股蓝多糖、丹参多糖等亦被报道[18-19]，这些多糖除了可增加精子活动率和存活率外，亦可保护精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性，并提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶等抗氧化酶活性，从而抑制活性氧的产生。另外，由于多糖类有一定的粘性，能够粘附于精子外围，在冷冻过程中亦可减少因冰晶产生而对精子细胞造成的破坏。

除此之外，目前已报道的冷冻稀释液中添加的组分还有：1.抗氧化剂类，可分为非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂，前者包括维生素C、维生素E、L-半胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、谷氨酰胺、肉碱、麦角硫因、牛磺酸、亚牛磺酸、亚油酸、褪黑素、丙酮酸、二硫赤鲜醇、锌、硒、白藜芦醇、苹果多酚、葡萄籽原花青素、番茄红素、线粒体靶向肽Elamipretie等物质[20-25]；后者包括过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、辅酶Q10及其衍生物等[26-28]。以前者研究较多，这些抗氧化剂一般可提高精子活动率、存活率、顶体完整性、质膜完整性、线粒体活性、SOD及谷胱甘肽过氧化物酶活性等，降低精子畸形率、DNA损伤和丙二醛（MDA）水平。2.黄嘌呤衍生物：包括咖啡因、己酮可可碱、可可碱等，它们可增加细胞内cAMP浓度,从而增强精子的活动能力，促进精子获能和顶体反应等。但有研究发现[29]，精子长时间接触咖啡因或己酮可可碱后，形态和膜完整性受到损害，可能会由于能量耗尽而影响生育潜力。3.三磷酸腺苷(ATP)：其不仅能提高精子活力，也可增强精子顶体反应，从而提高卵子受精力[30]。4.血小板活化因子（PAF）：其与精子表面的受体结合后可诱导三磷酸肌醇形成，进而上调细胞内钙浓度。已有研究证实[31]，PAF可通过影响精子的运动能力、获能和顶体反应来影响精子生育能力。5.自体精浆：如果通过梯度离心法等去除精浆中部分有害物质如活性氧、白细胞等，而保留有利于精子的成分，自体精浆可能有助于提高精子质量和活动精子回收率[32]。6.抗冻蛋白Ⅲ（AFPⅢ）：可通过降低冰点来抑制冰晶的形成。Saeed等研究发现[33]，在人精子冷冻培养液中添加1μg/ml AFPⅢ（最佳剂量）可以提高精子冷冻后的活动率、前向运动精子百分率、存活率和质膜完整性。7.其他：包括脂肪源性间充质干细胞（Ad-MSCs）[34]、L-肉碱[35]、二甲双胍[36]等。

三、无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻所面临的问题及可能的应对策略

尽管目前已有报道[37]，使用无渗透性冷冻保护剂进行玻璃化冷冻复苏后的精子，通过卵细胞质内单精子注射（ICSI）后成功获得健康婴儿，但这样的报道毕竟是个案，且基本为稀少精子冷冻，其是否适合精子库常规冷冻精液以及卵子和胚胎的冷冻，以及其操作的标准化、具体的保存机制及未来对婴儿健康的影响如何，尚不清楚。目前，无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻仍面临诸多问题。

一是术语的规范化。目前一些文献报道中均是以“无冷冻保护剂（cryoprotectant-free）”来描述精子的玻璃化冷冻，可在实际冷冻时冷冻稀释液中均存在一些非渗透性冷冻保护剂[38]，故标准术语应为“无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻”。

二是缺乏标准化的冷冻流程。目前文献报道的玻璃化冷冻程序包括液氮熏蒸或直接投入液氮中，液氮熏蒸时距离液氮面的距离和熏蒸时间均有差异，而直接投入液氮时不同的冷冻载体，由于接触液氮时产生的液氮蒸汽的影响不同，结果可能有很大差异。未来应对大家比较认可的冷冻程序，经过多中心研究后，建立标准化的冷冻流程。另外，不同类型冷冻载体的标准化冷冻流程亦应建立。

三是冷冻组分的添加应有大量实验依据后方可应用于临床。目前，关于添加组分的研究存在如下问题：1.同一组分在不同研究中有不同结论；2.一些研究是针对不同动物精子进行的，其是否适用于人类精子尚缺少依据；3.一些组分是在常规精子冷冻中进行的，其是否适合玻璃化冷冻亦需证实；4.一些添加组分并非人体或细胞内固有成分，其虽然能改善精子活力，但对精子代谢、未来受精卵及胚胎的发育是否有影响尚需验证；5.文献报道的如此多的组分，可否筛选出一个最优化的适合人类精子的组分组合，经多中心研究验证后，以应用于临床。

四、结语

理论上，卵母细胞、胚胎、睾丸及卵巢组织以及其它细胞组织也适合无渗透性冷冻保护剂的玻璃化冷冻，但相关研究极少。无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻技术虽有一些正常妊娠和分娩的案例，但要走向临床常规使用仍需大量研究验证。未来有关无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻的研究应集中在：1.探索无渗透性冷冻保护剂的精子玻璃化冷冻过程中的精子损伤机制；2.筛选并确定对精子功能有保护作用、对未来胚胎发育无害的非渗透性冷冻保护剂及添加组分，及其最佳剂量、组合及最佳添加时间；3.进一步优化和开发适合稀少精子冷冻和常规精液精子冷冻的载体，并将三维打印技术应用于冷冻载体的制备[39]。4.建立包括精液处理、冷冻、复苏等全过程的标准化冷冻程序；5.开发新的可以提供极高降温速率的自动化的冷冻设备，为实现大容量的无渗透性冷冻保护剂的玻璃化冷冻提供物质基础。