二代测序技术在实体肿瘤诊疗中的应用进展

翚 缨 曾 灏

广西壮族自治区贵港市人民医院检验科，广西贵港 537100

在临床上，恶性肿瘤具有细胞分化、转移、增殖等功能，发病机制十分复杂，可以划分为致癌、促癌和癌细胞演进这三个不同的环节[1]。近年来，随着医疗技术水平的不断进步，二代测序技术作为一种大规模的平行测序技术，逐渐应用于临床实体肿瘤的诊疗中，可以更好地分析肿瘤的发病机制、分子分型以及预后等各方面的信息，为临床肿瘤的诊疗工作带来了进一步的突破[2]。二代测序技术在肿瘤诊疗的过程中，可以通过信号通路和突变基因的技术应用，来识别实体肿瘤中的特异突变现象。目前，二代测序技术在实体肿瘤诊疗中的应用，明显促进了分子生物学的发展历程，并且也可以让临床医学者在研究基因组的测序问题中，以低成本获得高效率，在我国实体肿瘤的临床实践工作中，具有积极的促进作用。本研究将结合一些典型研究对二代测序技术在实体肿瘤诊疗中的应用进行如下综述。

1 二代测序技术简介

近年来，在人类基因研究的课题中，我们对于遗传信息的掌握越来越清晰；与此同时，随着科学技术的不断发展，基因检测技术的水平也得到提升，逐渐呈现出了规模化、工业化、专业化的特点。在第一代测序技术中，即Sanger 测序，虽其是基因检测的金标准，读长较长、精准，但由于其成本较高、通量低，限制了其在各个领域中的应用都存在部分缺陷[3]。而后经过技术人员的深入研发，在第一代测序技术中衍生了二代测序技术，与上一代测序技术相比，二代测序技术的范围重点在于基因组重测序、目标区域测序以及全外显子组测序，同时具有成本逐渐降低、通量高的优点，可以以高通量的输入来筛选多种基因，改变筛选基因的灵敏度。此外，二代技术还可以对大量的平行基因进行测序，在临床应用过程中，可以更好地探究实体肿瘤的变异性，为肿瘤的诊疗工作提供数据信息的支持。总的来说，二代测序技术对实体肿瘤的检测结果与一代相比差异并不明显，但是却具有检验通量、时间和筛选方面的优势，并且可以避免机体侵入性检查，能达到早期诊断、及时治疗的目的，同时在耐药性和疗效方面还具有明显的监测效果。

2 二代测序技术在实体肿瘤中的应用

近年来，二代测序技术在各个领域中的应用都十分广泛，特别是在肿瘤基因组学的研究中发挥了巨大的作用，用于突变基因、信号通路的探索以及识别特异性突变[3]。同时，二代测序技术还可以研究肿瘤质变的发展机制，有利于临床诊疗的实施，进一步推进了我国医学水平的进步。特别是在实体肿瘤的样品检测中，二代测序技术能够了解机体病变组织的基因改变机制，并为临床诊疗提供参考方向，有利于随时调整用药和靶向治疗方案，达到理想的治疗效果。在此，下文重点论述二代测序技术在实体肿瘤中的应用，并简单分析二代测序技术在临床应用的优点。

2.1 遗传性乳腺癌（HBC）

乳腺癌的发病率位居我国女性恶性肿瘤的首位，尤其是以浸润性导管癌为主。浸润性导管癌是一种具有高度特异性质的疾病，在基因谱、生物特性以及诊疗方向中都存在一定的研究难度，因此在临床上需要加强对此类患者肿瘤分期、病情诊治方面的研究力度，更好地用于诊断治疗以及预后评估中。在二代测序技术的应用中，基因表达谱不仅可以清楚了解患者的肿瘤分期情况和基因表达特性，同时还可以加深临床对病理组织细胞调节情况的认识，进一步强调肿瘤组织中的生物学特性。有研究表明[4]，乳腺癌的发病因素与体细胞突变有关，这为临床乳腺癌的诊治工作提出了重要方向。在此条件下，可以通过对肿瘤细胞突变谱展开研究，明确乳腺癌的发展机制以及细胞分子的变化情况。Bennett 等[5]分别对三阴性乳腺癌患者予以RNA 测序和DNA 测序；Ellis 等[6]对所选的乳腺癌患者进行DNA 测序，均研究NGS 应用于体细胞突变谱的检测效果。其中部分患者行全基因组测序，其余患者行外显子组测序，两组结果均提示，二代测序技术可以综合基因组的发展情况，分析乳腺癌细胞分化、突变和转移方面的特征，促进了临床乳腺癌基因研究的进展。

HBC 在临床上大多是由BRCA1 和BRCA2 突变引起的，两者的基因编码肿瘤可以抑制机体的蛋白生长、分化，造成DNA 修复功能受损，同时还对细胞周期的变异、基因转归、基因稳定方面起到关键作用。细胞组织突变会增加HBC 的发病风险，针对此类现象，临床应加强对家族史患者的筛查和测试。传统的DNA 测序具有检测时间长、费用较高等缺点，而采取二代测序技术则可以达到低成本、高效率的效果，改善了传统测序检测方法的局限性，也能够合理应用于临床的常规诊断中。

2.2 胃癌（SC）

SC 是消化系统中常见的恶性肿瘤之一，随着人们生活方式的转变，SC 在临床上的发病率逐渐上升。而近年来，有研究表明[7]，SC 的发病机制与基因因素的改变存在密切关系，其中包括基因突变、基因表达异常以及基因遗传变异等。在二代测序技术中，可以通过对SC 组织的肿瘤分子标志物进行检测，提取RNA 或者DNA 以获得机体的基因信息，从而了解SC 患者发病进程、用药等方面的问题；同时可以通过基因表达鉴别不同个体中的表达特点，更有利于预后，实现SC 转归向好，筛选出与基因表达异常的靶基因，剖析临床诊疗方案的调控机制。Lim SM 等[8]对早期SC 患者的癌旁组织进行二代测序，研究机体基因表达水平的差异以及结构变化，结果显示，在早期SC 患者的病理标本组织中，存在1602 个基因上调以及695 个基因下调；30% ～40% 的SC 患者还存在融合基因LRP5-LITAF，这提示早期SC 患者的基因表达异常多与肿瘤期数、侵入和扩散程度有关。其次，有学者[9]指出miRNAs 在实体肿瘤的病程演变中，也起到了至关重要的提示作用，在临床诊疗方面也具有较大的潜力，同时还参与了SC 形成的多样通路信号。Lin PH 等[10]在FFPE 标本中应用二代测序技术，分析其生物学信息，研究组织标本的RNA 降解、片段化程度。结果显示，在新鲜冰冻的标本中提取RNA 具有完整保存的效果，而从石蜡中提取RNA，则会出现程度不同的降解现象，同时28S 和18S 的波峰相对来说表达并不明显；miRNAs 的表达谱在新鲜冰冻标本中，相关系数为0.91，而在FFPE 标本中则为0.85，均提示FFPE 标本中的miRNAs 保存度更为完整，且可以通过二代测序技术进行SC病理组织的检测。二代测序技术规模性和专业性较强，在SC 组织中的检测可以准确描述细胞转录组的相关情况，并提示基因表达和结构变化的特征，揭示了肿瘤分子的分型。

2.3 肝癌（HCC）

HCC 是外科中常见的恶性肿瘤之一，目前临床上对于肝脏恶性肿瘤的发病机制仍在研究中，大多数学者普遍认为其病因是多因素、多复杂的演变过程，但主要是受到饮食因素和环境因素的影响所致。目前，临床上用于HCC 诊断的种类较多，传统的检测方法包括CT、核磁共振、超声等，同时仍需要采取肿瘤标态物检测，在检测过程中对于肿瘤的体积有一定的要求，因而存在漏检率较高的不足之处。而二代测序技术在肝癌的早期筛查中早已有着广泛的应用，研究表明[11]，许多癌基因的分化发展与肝癌的易感性存在密切的关联性。Stephens等[12] 在HCC 多个基因突变和发病机制研究中，发现许多癌基因与HCC 易感性关联密切，进一步提出HCC 并不是单基因突变的恶性肿瘤这一概念，并且将肿瘤组织的基因作为筛查重点，对早期HCC患者进行血液检测，提取其DNA 文库，通过二次测序技术检测患者血液中是否存在肝癌相关的基因样本，即CtDNA。这提示二次测序可以用于HCC的早期诊断中，筛查率较高，确诊率不断向100%的方向靠近，同时还能依据检测出现的靶点予以治疗方案的指导，在研究靶点药敏性中也具有明显优势和成效。

2.4 肺癌（LC）

在临床上，LC 是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤。在2019 年，英国有关研究人员提出了一种新的检测技术，即将血液检测和计算机断层扫描成像相结合，以便于早期LC 的识别和干预[13]。但是对于LC 伴随EGFR 基因突变的患者来说，这种检测方法效果较差，并且难以对临床治疗提供判断方向。有研究表明[14]，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在治疗晚期非小细胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）中具有明显优势。而在二代测序技术的应用中，研究机体EGFR 基因突变的进程，可发现基因变化产生的区域均存在于酪氨酸激酶中。Barras 等[15]在表皮生长因子受体络氨酸激酶抑制剂的研究中发现，NSCLC 伴EGFR 基因突变患者的治疗效果，并提出EGFR 突变类型包括外显子点突变、缺失突变、插入突变，主要发生于18 ～20号的外显子。相关文献报道表明[16]，EGFR 基因突变的不同程度均对临床疗效产生不同的指示性特征。然而，在实际的检测工作中，由于LC 病理组织的活检标本难以重复获得，并且受到检测时间的影响，待结果呈现之时癌细胞早已转移或扩散，增加了手术治疗的难度。约有54% 的组织基因突变患者，通过二代测序技术对EGFR 进行鉴定突变的测试，可以给予此类患者更多可选择的治疗机会[17]。针对此类情况，有学者[18]指出这是由于肿瘤细胞含量较低所致，因此在二代测序技术的应用中，还应同时加入更为灵敏的检测方法，例如液体活检。在液体活检中，可以评析机体血液样品标本中的CfDNA 水平，以确定靶向治疗的患者，并对患者予以分子动态变化的检测。

2.5 结直肠癌（CRC）

CRC 的发病率居于全球恶性肿瘤发病率的第三位，好发于老年男性群体，严重威胁着老年患者的生命安全，而在近年来，由于人们饮食结构的转变，CRC 的发病趋势呈现出了低龄化的特点。在肿瘤细胞的发展进程中，EGFR 全程参与其中，具有调节肿瘤细胞的作用，对其生长功能、修复功能以及侵袭、转移方面都存在一定程度的影响，而在临床治疗中多以药物的相互组合作为靶点治疗的方法。但是，有学者指出[19]，EGFR 的单克隆抗体治疗，即西妥昔单抗或者帕尼单抗，都难以普遍应用到临床CRC 患者的治疗中，因此需要非癌细胞转移患者应用二代测序技术检测用药治疗的反应，减少患者在治疗过程中的不必要医疗支出，同时能够更好地监测不良反应的发生情况。RAS 蛋白作为一种下游效应子，旨在将基因功能的变化情况从EGFR 传输至细胞内，成为信号传输的重要标志；而KRAS 用于预测生物标志物的有效性，对于具有KRAS 突变的患者来说，可以起到抑制剂的抵抗作用[20]。大约45% 的KRAS 外显子2 的患者，难以从靶向药物的提示中获得理想的诊疗方向，而CRC 中的基因突变或者下游突变，受到遗传基因异常改变因素的影响，导致抗EGFR 的耐药性逐渐升高，临床疗效并不明显，因此CRC 病理组织的异常特性是预测CRC 治疗的关键。

2.6 其他肿瘤

除了上述五个比较常见的实体肿瘤外，二代测序技术在其他实体肿瘤的诊断、治疗以及预后中的应用也是比较广泛的。如食管癌、黑色素瘤、甲状腺癌瘤等。乔云等[21]研究指出，在食管癌患者中应用二代测序技术探索敏感基因，可以提高放射治疗的敏感性，这提示二代测序技术在食管癌患者的个体化治疗中能够予以特殊的干预和指导。Mari 等[22]通过NGS 来研究散发性甲状腺髓样癌的诊断分层，发现二代测序技术可以对甲状腺癌的诊治提供诊疗方向，更好地区分甲状腺结节的分类变化，降低并发症的发生率，改善诊断性穿测的发生情况。Adan 等[23]用二代测序技术、免疫组织学这两种方法检测黑色素瘤，包括检测灵敏度、时间、成本等，结果显示，二代测序技术对于黑色素瘤的检测效果更为显著，并且也阐述了分子诊断的多种优势，倡导临床不断推进二代测序技术的应用。此外，Illumina 公司的TruSight Tumor 主要用于查看实体瘤中的体细胞变异情况，包括肺癌、结肠癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌，可以准确提示肿瘤患者基因突变的概率，并分析机体变异的具体情况[24-26]。而在实体肿瘤的预后方面，二代测序技术的应用可以为肿瘤筛查、诊断和治疗提供新的方向，在临床使用中具有巨大的发展潜能。

3 小结与展望

随着现代医学技术的蓬勃发展，临床上逐渐将信息数据的模式应用于诊疗工作中，在实体肿瘤的诊疗过程中更是做到了个体化治疗的精准结合，有效提高了诊断率和治疗效果。而在现代医学技术的应用中，二次测序技术作为一种新的检测手段，旨在通过DNA 片段的深度探查，来获得机体或疾病的基因组信息，明确肿瘤在病情发展阶段的细胞变化情况。此外，二代测序技术具有灵敏度高、检测时间段广泛、通量高、信息量大等优点，在实体肿瘤的诊疗中起到了十分重要的作用。

综上所述，二代测序技术的应用为实体肿瘤的诊疗工作带来了更深层次的变革，特别适用于基因遗传、变异等相对复杂的疾病种类研究中。在未来几年，随着二代测序技术的深入研究和应用，有望将其引进血液癌症的诊疗中，不断完善基因组谱的评估情况和临床实践，提高测序技术的实用性。与此同时，还应加强对第三代测序技术的研发，弥补原有测序技术的局限和不足，为临床诊治补充更为丰富的技术要点。在基因组学不断变化发展的当下，测序技术也应适应新模式的转变，有望将二代测序技术与三代测序技术相互联合，应用于临床实体肿瘤的诊疗工作中。