阿尔茨海默病早期诊断的生物标志物研究进展

谢文然 ，丁旭科 ，李遇春，傅 攀，王志敏，龚莎莎 *

（1.台州学院 医学院，浙江 台州 318000；2.台州市第一人民医院，浙江 台州 318000）

0 引言

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又称老年痴呆症，是一种神经系统退行性疾病，主要表现为渐进性记忆减退、认知功能障碍以及其他神经精神症状和行为障碍。AD是痴呆中最常见的类型，并且在老年人中的发病率随着年龄的增长而升高。世界卫生组织发布的一项报告显示，全球现有约5 000万痴呆患者，其中AD患者占60%～70%。根据流行病学数据预测，2050年全球AD患者可能超过1.52亿［1］。

美国国家衰老研究院和阿尔茨海默病协会（NIA-AA）共同发布的AD最新诊断指南将AD分成了三个阶段，即临床前AD阶段、轻度认知损害（MCI）阶段和痴呆阶段［2］。AD病因未明，尚无良好的预防手段，目前仅有针对该病症的缓解药物，没有有效的治疗途径来阻止甚至延缓痴呆病程的进展［3］。因此，AD的早期诊断已成为AD防治工作的重点。AD的临床诊断耗时繁琐，需要结合临床评估、心理测试、影像学检查等，以排除其他神经系统疾病［4］。最新指南明确将生物标记物作为AD临床诊断的指标［5］，尤其在AD发病早期，几乎是唯一手段［6］。

因此，寻找高敏感性和特异性的生物标志物用于早期诊断是目前AD研究领域的重要目标。本文利用 Pubmed、Medline、CNKI、万方等中英文数据库，通过对“阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）、早期诊断（Early diagnosis）、生物标志物（Biomarkers）”等关键词的检索，收集了2010年1月到2019年10月期间的相关文献资料，就目前临床上已经应用或处于研发阶段的AD生物标志物研究进展情况展开综述。

1 AD早期诊断的生物标志物

Aβ沉积形成的老年斑（senile plaques，SPs）和Tau蛋白过度磷酸化导致的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）是AD的主要病理变化［7］。AD具体致病机制尚未明确，目前被国内外公认的主要学说包括：β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）异常沉积学说、Tau蛋白过度磷酸化学说、免疫炎性反应学说、线粒体功能紊乱学说、氧化应激学说等［8］329［9］。基于AD分子致病机制的研究，越来越多的生物标志物被发现，如表1所示：

1.1 前β淀粉样蛋白代谢标志物

Aβ由前β淀粉样蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）水解产生，APP是一种跨膜神经元蛋白，当APP代谢异常时，Aβ生成增多或清除减少均会造成其大量沉积［22］，随后引起胶质细胞产生炎症反应、氧化应激增强、线粒体功能障碍、细胞凋亡以及胆碱神经元末梢异常等连锁反应［9］。Aβ在体内主要以Aβ42、Aβ40两种形式存在［22］。在临床症状出现前，AD患者脑脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）中的Aβ42浓度就已下降，而Aβ40水平略微增加或不变［11］656［23］。也有研究者认为，由于神经退行性疾病的复杂性及个体间Aβ水平差异，单一CSF的Aβ42测定并不完全适用于AD早期诊断［11］656［24］，计算CSF的Aβ42/Aβ40比值能更好地提高AD早期诊断灵敏度与精确度，以区别其他神经退行性疾病［11］656［25］。AD患者大脑的APP代谢异常也可反映在血小板中，血小板含有中枢神经系统内APP代谢所需的酶，是外周血循环中Aβ的重要来源［26］。APP130kDa/APP110kDa即血小板前β淀粉样蛋白亚型比（amyloid precursor protein forms ratio，APPr）是近年来发现的一种有望用于AD早期诊断的生物标志物［27］。AD患者血小板的APPr与非痴呆老年人相比显著下降［13］1042。APPr预测MCI进展为AD的灵敏度及特异度均为75%，但APPr最终是否可以作为AD早期诊断的生物标志物仍需要大量样本试验［27］。

Aβ以单体、寡聚体和纤维等不同状态存在于人体中，其中寡聚体Aβ是导致AD中认知功能障碍和神经退变的重要因素［28］。Aβ寡聚体按分子量和聚集状态不同可分为二聚体、三聚体、四聚体、Aβ*56、球状结构寡聚体以及链状结构寡聚体，然而具体何种Aβ寡聚体对AD造成的神经元毒性最强仍没有定论［28］。研究发现，AD及MCI期患者CSF中的Aβ高分子寡聚体浓度显著高于非痴呆老年人，Aβ高分子寡聚体既可以作为AD诊断的标志物，也可以作为反应疾病进展程度的潜在生物标志物［14］2716。

1.2 病理缠结标志物

Tau蛋白是由MAPT编码的微管相关蛋白，可结合并稳定神经元中的微管，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束［29］5。Tau发生过度磷酸化时，缺乏对微管的亲和力，自身缔合成成对的螺旋丝结构，最终形成NFTs，造成神经元损伤，使患者认知功能下降［7］。AD及临床前期AD患者CSF的总Tau蛋白（Total Tau protein，T-tau）浓度较非痴呆老年人显著升高，AD患者CSF的T-tau平均浓度增加1.5倍［30］。高浓度的CSF T-tau可反映神经元变性的强度及MCI向AD的进展程度［31］。但在其他神经退行性疾病如克雅氏病、脑中风中也发现了高浓度的CSF T-tau，其中克雅氏病CSF T-tau浓度较AD高10～20倍［32］830。应用CSF T-tau/Aβ42比值区分AD与其他类型痴呆也具有高度的准确性，诊断AD的灵敏度达95%，特异度超过84%［33］。

NFTs的主要成分是过度磷酸化Tau蛋白（phosphorylated tau protein，P-tau）及其聚集物，AD患者脑中蛋白磷酸酯酶（PP2A）活性受抑制，Tau蛋白的多个位点受GSK-3β、CDK-5及其活性亚基P25调控发生磷酸化，形成P-tau［29］7［34-35］。AD患者CSF的P-tau浓度升高较T-tau浓度升高更具特异性，可反映NFTs负荷程度及Tau蛋白磷酸化状态，更适合作为AD早期诊断的生物标志物［36］。由于磷酸化位点差异，目前已报道的P-tau主要有P-tau181、P-tau231、P-tau199、P-tau235等，其中CSF的P-tau181、P-tau231、P-tau199有助于鉴别AD与其他神经退行性疾病及非痴呆疾病［37］。此外，也有将CSF的P-tau181浓度升高联合Aβ42浓度降低用于预测MCI进展为AD［38］。

1.3 神经系统退行性疾病相关标志物

神经系统退行性疾病通常存在蛋白质的异常沉积，轴突和神经元的损伤以及胶质细胞增生等变化。AD患者CSF中神经丝蛋白（AD7c-NTP）、神经丝轻链蛋白（NFL）、类视锥蛋白1（VLP-1）、心型脂肪酸结合蛋白（hFABP）等不同程度的升高被认为可能与AD的发生发展紧密相关［10］673。AD7c-NTP是一种跨膜磷蛋白，存在于中枢神经系统中，AD7c-NTP的过表达可导致神经炎及神经元损伤［15］1498。已有研究显示AD组尿液AD7C-NTP浓度高于正常对照组，尿液AD7c-NTP水平在预测AD和MCI中β淀粉样蛋白沉积方面具有高灵敏度和特异性［15］1498［39］93。

VLP-1是一种神经元钙传感蛋白，参与突触塑造相关的信号通路。Ca2+稳态改变，可引起CSF中VLP-1浓度增加，导致含VLP-1的神经元损伤［40］。NFL是构成神经细胞轴突中间丝的蛋白，其为轴突提供结构支持并调节轴突直径，影响神经传导的速度。当神经元或轴突损伤时，NFL释放到CSF及血液中［41］。Olsson等的meta分析显示AD患者CSF中的VLP-1浓度及NFL浓度均高于非痴呆老年人［10］681。此外CSF VLP-1，血浆NFL已被证明可用于预测MCI向AD进展，然而这些标志物是否可用于AD患者的早期诊断及预后监测还需进一步的研究来证实［32］836。

hFABP在大脑中高度表达，其参与轴突的形成与突触塑造［42］。一项meta分析［10］676表明AD患者CSF的hFABP浓度显著高于非痴呆老年人。此外，Guo等人［42］发现MCI与AD患者CSF中的hFABP没有显著差别，他们推断CSF中的hFABP浓度可能在AD早期就已增加，hFABP水平可能具有早期诊断AD的潜力。

1.4 胶质细胞炎症反应相关标志物

免疫炎症反应在AD的发生发展中起着重要作用，大量积蓄的Aβ激活小胶质细胞释放炎性因子如白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、转化生长因子β（TGF-β）以及人类软骨糖蛋白-39（YKL-40）［43］，持续暴露于细胞因子的神经元发生结构和功能变化［8］329［43］。另有一项 Meta 分析表明，AD 患者CSF的TGF-β和YKL-40水平与对照组相比显著升高，而CSF IL-6、LI-8、IL-1β水平与AD则无显著相关性［16］。

1.5 氧化应激反应生物标志物

氧化应激被认为参与AD的发病过程，且与Aβ的存在密切相关。Aβ可通过多种途径诱导活性氧（ROS）的产生，损伤线粒体和内质网的膜结构，大量Ca2+进入胞质，使细胞Ca2+超载，引起细胞器受损，神经元凋亡［8］337-338。有研究表明AD病人富含Aβ的大脑区域，存在高浓度蛋白质、脂质和核酸的氧化产物［44］。García-Blanco等通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法分析来自MCI和AD患者的尿液样品，发现脂质过氧化产物如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、异前列腺素（Isporostanes，IsoPs）等在病例组和对照组之间存在差异，揭示上述过氧化物可能是潜在的早期AD生物标志物［17］。

1.6 遗传易感标志物

遗传易感标志物（基因）检测可以识别遗传缺陷，早期预测和发现AD。迄今为止已定位数百个与AD发病相关的基因突变位点，其中位于21号染色体（21q21.1）的APP基因突变、位于14号染色体（14q24.3）的早老素-1（PSEN1）基因突变、位于1号（1q42.1）的早老素-2（PSEN2）基因突变显性遗传AD早发的主要因素。三种易感基因在人群中的突变率较低，致病性突变大多发生在重要的功能域［45］。利用PiB-PET、FDG-PET和MRI等影像学技术扫描上述三个基因突变携带者的脑部特定区域，评估脑部空间变化，可以初步估算平均发病年龄［46］。

1.7 其他标志物

MiRNA在中枢神经系统中大量表达，主要参与神经元的形成、分化和突触塑造。已发现多种血清miRNAs在AD中差异表达，对AD的临床分期起着重要作用［47］，其中miRNA-342-3p区分AD与非痴呆老年对照的敏感度和特异度分别为81.5%和70.1%［18］。

微量元素对于大脑发挥正常功能具有重要作用［32］835［20］353。Ferritin是人体主要的铁储存蛋白。分析ADNI数据库发现AD、MCI及非痴呆对照人群CSF的Ferritin浓度无显著差异，而Ferritin浓度增加与认知功能下降有关，并且可用于预测MCI向AD进展［19］。慢性铅（Pb）暴露易对神经产生毒性，是造成人类认知功能下降和死亡率增加的重要原因之一［20］353-354。已有研究利用单色X射线荧光法（M-XRF）检测尿液Pb浓度探究尿铅与AD的相关性，但实验结果显示，AD患者尿液Pb浓度与正常对照无显著性差异［21］。

2 AD生物标志物的样本来源及临床应用

2.1 脑脊液（CSF）

CSF充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内，具有缓冲、保护、运输代谢产物和维持颅内压的作用。若中枢神经系统发生病变，神经细胞代谢紊乱，将使脑脊液的性状和成分发生改变，因此脑脊液是AD生物标志物的丰富来源，如图1所示。目前，绝大部分的AD生物标志物研究都集中在CSF样本来源，尤其是核心生物标志物T-tau、P-tau以及Aβ42已经在AD患者鉴定中显示了高敏感性和特异性［10］673［11］654，在尸检确诊的AD病人中也得到相同的结果［48］。有研究将CSF Tau/Aβ42比值与MRI检查结果相结合，预测MCI转化为AD的敏感性和特异性分别达到85%和96%［49］。然而，CSF的采集是一种侵入性的采样方式，受试者顺应性较差，可能引起部分人群偶尔的不适或副作用，限制了其在AD早期人群中的推广应用［12］。

2.2 血液

AD病因复杂，AD患者大脑中Aβ、Tau蛋白的积聚总是伴随着其他组织的病理生理变化［50］653。血液含有蛋白质、多肽、核酸、脂质和其他代谢物，且血液标本获取方便、侵入性小，因此基于血液的生物标志物将有助于阐明AD的复杂性和异质性，并且能提供一种快速、非侵入性且成本低廉的早期检测策略［51］。随着免疫沉淀、质谱分析、单分子阵列等高灵敏技术的应用，已有研究表明AD病人血浆Aβ42相较于正常对照及MCI期患者有下降的趋势，Tau水平与正常对照相比升高且可能与AD病人认知功能下降相关［50］656-657。然而血液成分复杂，潜在的AD生物标志物以低浓度形式存在于血液中，发生于外周循环的系列生理反应都可能限制基于血液的AD生物标志物的临床应用。

2.3 尿液

与受体内平衡机制调节而稳定的血液不同，尿液可以更早积累多种与疾病相关的代谢变化［52］。一项对脑部疾病的尿液生物标志物研究表明，尿液是脑部疾病生物标志物的潜在来源［53］。此外，尿液获取无创便捷且可重复，有利于监测疾病进展，是疾病早期生物标志物检测的理想体液标本。已有研究显示尿液AD7c-NTP水平在预测认知功能障碍患者的Aβ沉积方面具有高特异性和中度敏感性［39］91-93。然而，尿液组分代谢快，稳定性不高，尿液生物标志物的检测技术对设备和技术人员操作要求高限制了其在临床的推广。

2.4 唾液和鼻黏膜

唾液由唾液腺和黏液膜分泌，Tau蛋白在唾液腺中高度表达，APP和Aβ42在人唾液上皮细胞中表达［54］。唾液作为体液易于获得，已有科研人员通过唾液来寻找AD相关生物标志物［55］。另外嗅觉功能障碍是各种神经退行性疾病的早期和常见征兆，大约90%的AD患者存在嗅觉障碍［56］。有证据显示，嗅觉障碍程度可用于预测患者从MCI转化成AD的可能性［57］。在正常老年人中具有嗅觉障碍的患者认知下降得更快，并且与痴呆和神经变性疾病的发病相关。因此，鼻黏膜可以成为AD生物标志物检测的潜在样本来源［58］。

3 展望

随着人口老龄化的加剧，AD已成为影响人类健康的重大公共卫生问题。AD致病机制研究不断深入，使得越来越多的生物标记物被发现并应用于临床。但是AD致病机制的研究仍有待深入，从SPs和NFTs的形成到神经元的变性、死亡是一个极其复杂的过程，其中包含多种因素的相互影响。基因组学、转录组学、蛋白组学及代谢组学等高通量组学技术的发展，加速了新型生物标志物的研发。尤其是代谢组学，通过磁共振波谱和质谱等技术，监测代谢产物图谱的动态变化，在筛选疾病相关生物标志物上显示出较大优势，在阐明AD的分子致病机制及其导致的病理生理变化方面具有广泛的应用前景。

CSF是AD诊断的重要样本来源，具有高特异性和敏感性。而血液、尿液、唾液和鼻黏膜等样本来源的深入研究，将提高AD早期诊断的可操作性，利于临床推广应用。针对现有生物标志物，开发AD新型诊断技术，建立标准化检测方法，提高AD的鉴别诊断效率是AD研究仍需努力的方向。