组织工程技术在听觉再生中应用的研究进展

郜增 娄向新

东华大学（上海201620）

长期暴露在高分贝的环境、细菌感染、药物滥用，以及一些相关的疾病等都可能导致内耳毛细胞不同程度的受损或丢失，并继而引发相连的螺旋神经节细胞的损伤和功能丧失，最终可能造成永久性的感音神经性耳聋[1]。据报道，全球约有11亿青少年因不正确使用电子产品及配套耳机等音响设备面临听力损伤风险[2]。目前，听力中度损伤和高度损伤的治疗分别通过助听器和电子耳蜗的植入。虽然当今医疗技术发展日新月异，但目前临床上尚没有安全性好、可行性高、效果显著的治疗方法来修复听觉的损伤。组织工程技术主要通过生物学、医学、电子信息学与工程学的多学科交叉融合，以生物性替代和修复受损组织或器官为主要目标，研究和开发人体组织器官损伤后功能和形态修复的一门新兴学科[3-5]。虽然组织工程技术的诞生不足40年的历史，但是经过科研人员的不断努力，该技术已经广泛应用于人体各种组织器官的修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态重建，例如组织工程化的骨骼，血管和皮肤等[6]。近年来，研究人员在内耳柯蒂氏器和听觉基底膜体外模拟构建，以及细胞外基质诱导毛细胞再生的研究和利用方面取得了一定的突破性研究进展。本文就组织工程技术在听觉再生研究中的最新研究进展进行综述，以期为听觉损伤的临床诊治提供了新的解决思路。

1 柯蒂氏器类器官的构建

柯蒂氏器又称螺旋器，为听觉末梢的感受器，位于基底膜上的中阶内，由外毛细胞、内毛细胞[7]、支持细胞等听觉感觉细胞所组成[8]。柯蒂氏器负责将一系列的机械刺激转化成电信号，形成神经冲动然后通过听神经传递到大脑的听觉中枢，进而产生听觉。李华伟教授[9]和Oshima等[10]分别研究发现，内耳耳蜗内组织微环境对听觉细胞的发育和组织形成具有重要的调控作用，将干细胞进行鸡胚听泡体内移植或是体外与鸡胚椭圆囊基质细胞共培养的方法可以促进其向听觉毛细胞分化，研究结果表明内耳干细胞所处的微环境以及与周围细胞的相互作用对内耳毛细胞的再生和功能重建具有重要的作用。但利用鸡胚椭圆囊基质细胞诱导毛细胞分化的步骤繁琐、不同种属细胞之间易交叉污染、诱导信号及有效诱导成分不明确，极大限制其研究和应用。同时，在传统二维（two-dimensional，2D）培养体系中，各种方法诱导干细胞形成结构独特、功能齐全、细胞类型复杂的柯蒂氏器结构的能力非常有限。越来越多的证据表明，在相关的支架中三维（three-dimensional，3D）培养不仅对控制干细胞的增殖和分化是必要的，而且对干细胞向更高阶结构(如类器官)的发育非常至关重要[11]。

近年来，Koehler等[12-15]利用基质胶（Matrigel）包被胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）制备3D悬浮培养系统，成功地将小鼠ESCs转化成内耳听觉上皮样结构，命名为“类Corti氏器”。三维悬浮培养使得细胞能够利用胚胎发育过程中的生物信号和力学刺激，提供一个更接近人体早期听觉发育的微环境，诱导分化后的内耳类器官包含听毛细胞、支持细胞及螺旋神经节细胞等内耳功能细胞，细胞成规整性排列并检测到神经冲动的释放，这些结果对于揭示内耳听觉细胞再生机制以及今后研究听觉功能重建具有重要指导作用。然而，Koehler的3D培养模式依赖基质胶包被ESCs而形成的团块结构，以至于不同层流的细胞接触诱导因子的诱导效应不均衡，没有全方位模拟出听觉上皮的多层立体结构[14]。同时，基于基质胶而建立的类Corti氏器只能模拟内耳前庭的听觉上皮的片层结构，不能实现对耳蜗Corti氏器的3D[16]分层多孔结构和力学性能的真正模拟。不过，Koehler的开创性工作给后来的听觉再生研究者带来重要启迪，类Corti氏器官的构建和干细胞技术的结合是一个很有前途的发展和再生研究的概念。

2 耳蜗基底膜仿生模型的建立与应用

基底膜中的主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖，它们分别在听觉细胞发育和功能化过程中起到重要的作用[17]。听觉的产生是由外界声波振动引起周围空气产生的疏密波，再通过外耳和中耳组成的声音传导系统传递到内耳耳蜗，耳蜗内基底膜的振动是以行波的方式传播的，而基底膜的振动是非线性的。柯蒂氏器成规整的镶嵌模型与其底部基底膜相连，可以将声波传导导致的机械刺激转化成电信号，再通过听神经传递到大脑的听觉中枢，进而产生听觉。因此，体外构建力学特性、成分组成及诱导信号负载等综合的耳蜗基底膜仿生模型不仅能对耳蜗的拓扑结构和生理特性进行模拟与研究，而且可以听觉细胞再生及整个听觉损伤修复的研究提供思路和方向。Bekesy[18]描述了耳蜗中基底膜的运动形态，继而构建一维耳蜗简单的力学模型。杨俊等[19]根据流体的运动定律和基底膜的运动特性，设计耳蜗外淋巴液二维非线性运动方程模型，模拟结果表明，该模型部分表征了一些生理学实验。缪吉昌等[20]设计出了与人耳结构非常接近的3D模型进行模拟，建立一种仿生结构的富含淋巴液和基底膜的盒状模型，可以准确模拟基底膜的频率选择性。王如彬[21]等阐述了外毛细胞在增加基底膜频率选择性的机械过程中的延时特性，建立了具有延时作用的基底膜主动耦合模型，从一个新的角度解释了外毛细胞运动对基底膜振动作用。人工耳蜗（cochlear implant,CI）[22,23]的声学模型可以将原始声音信号经过前期步骤的处理，最终合成一种声刺激信号的信号处理算法或声码器。林楚湘等[24]建立了一种新的CI仿真声学模型版本可以提供直接的电脉冲-声脉冲映射仿真，该新模型表现出了比经典模型更敏感的特性。以上研究采用不同方式模拟了基底膜的结构和物理特性，以及仿生内毛细胞和神经纤维间神经递质的动态传递过程，有助于解析外周听觉系统中的耳蜗基底膜、听觉毛细胞和神经纤维等的工作机理，进而为研究人类听觉系统损伤的修复和再生提供一定的组织工程学和生理学证据。

3 脱细胞基质对毛细胞的再生作用

3.1 细胞外基质的重要生理作用

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)[25,26]是一种具有生物活性的天然生物复合材料，它对组织细胞起支持、保护、营养作用，对细胞的增殖、分化等生命活动有重要影响。脱细胞技术是目前获得ECM主要采取的方法，一般是指异体组织经细胞灭活处理后，通过脱细胞工艺去除细胞而保留其生物活性成分和结构，是含有多种信号分子构成高度协调的有机统一体，主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡糖、结构蛋白等。脱细胞基质材料修复缺损组织再生的机制是“内源性诱导再生”，脱细胞基质中的胶原纤维形成三维多孔连通网络结构，为细胞迁移、长入、合成新生胶原蛋白提供物理微环境，而保留细胞外基质中的各种活性成分与生长因子，实现组织的形成和结构重塑。从仿生学角度看，脱细胞基质是机体组织修复的基础，能够诱导并促进细胞的黏附、增殖、分化及组织形成，是最适合细胞和组织生长的生物材料[27]。

3.2 两种重要的外源性活性因子

近年来研究结果显示，哺乳动物内耳感觉上皮中存在内耳干细胞或前体细胞，由于增殖能力以及与之相关的调控机制处于相对抑制状态，无法通过自身的增殖和分化，修复和再生受损毛细胞[28-30]。ECM中一些关键的外源性活性因子（细胞生长因子和分化因子）对毛细胞的再生具有关键的诱导作用，且可以提供专门的微环境来调节干细胞的行为，有可能参与对听觉细胞损伤的修复。Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种能够促进成纤维细胞生长的物质-碱性成纤维生长因子（bFGF）对内耳支持细胞的增殖具有促进作用，支持细胞是毛细胞再生的前体细胞，因此bFGF对内耳毛细胞的再生有促进作用。EGF是一种小分子多肽链，能够有效的促进细胞的分裂，可以促进体内或体外的多种组织和不同类型细胞的分裂增殖。赵玉林等[31]发现EGF在小鼠耳蜗上皮发育中的表达呈现明显的阶段性及组织特异性分布的特点，说明EGF参与小鼠耳蜗上皮的发育过程，其在小鼠耳蜗上皮发育的增殖期有阳性表达。

3.3 脱细胞外基质的构建

由于听觉耳蜗柯蒂氏器的复杂膜性结构，利用组织工程技术基于听觉组织再生的脱细胞基质开发与研究一直进展缓慢。多年来脱细胞基质的研究主要集中在利用物理、化学和生物方法脱去活组织的细胞结构从而得到脱细胞组织用去组织工程化的再生新组织的构建。Santi等[30]取材新鲜耳蜗用去垢剂脱去细胞结构，获得脱细胞结构的耳蜗组织，同时研究发现层粘连蛋白和IV型胶原等细胞外基质中重要的活性蛋白仍然保留在脱细胞耳蜗的血管网、基底膜和螺旋缘等部位。这种脱细胞结构的耳蜗组织ECM的组成和结构可以作为一种新型载体用于毛细胞和听觉螺旋神经节细胞的再生研究。Mellott等[29]也证明来自人脐带间充质干细胞接种在去细胞化的耳蜗ECM中,发现脱细胞的耳蜗ECM可以促进毛细胞标志蛋白Myosin VIIa的表达，表明耳蜗ECM的成分和拓扑结构可能参与了干细胞分化的诱导。虽然天然动物耳蜗组织脱细胞诱导人干细胞向听觉细胞分化作用已初见端倪，但由于天然组织的免疫排斥反应，及异种细胞接种易导致种属交叉感染，等方面的副作用极大限制了耳蜗组织ECM的研究和应用。Oshima等[10]将iPSCs分化成表达Pax2和Pax8的内耳前体细胞，然后进一步引导内耳前体细胞在纤连蛋白、明胶和灭活的鸡胚椭圆囊基质细胞等不同基质上进行分化，发现只有在鸡胚椭圆囊基质细胞上分化的诱导多能性干细胞，才能产生表达静纤毛标志蛋白Espin的细胞。但目前鸡胚椭圆囊基质细胞共培养诱导多能干细胞分化为毛细胞的分子机制还不甚明了，分化产生的毛细胞不具有典型的毛细胞特性，没有功能性。同时，单独的细胞共培养，缺乏合适的空隙和良好的三维空间结构及必要的可塑性。因此，采用一定的理化处理方法构建仿生可降解的纳米纤维支架来负载活性脱细胞基质成分，是将来诱导毛细胞再生的重要研究方向。

4 组织工程化载药体系的构建及应用

目前除了助听器和电子耳蜗植入外，药物治疗一直是内耳疾病的另一主要治疗方法，但是内耳与全身血液循环之间存在血-迷路屏障，所以药物进入内耳的剂量就非常有限，因而需要内耳局部直接给药。内耳局部给药不仅可以减少药物剂量和药物对人体的不良反应，还可以提高药物在内耳的作用效率。圆窗膜[32]由三层结构组成，中层为结缔组织，外层和内层分别和中耳、内耳的黏膜相连接，其本质为一个半透膜可以允许小分子药物的渗透。Parnes等[33]实验证明在向鼓室注射地塞米松后，可以在内耳的鼓阶、中阶和前庭阶内检测到该药物，说明地塞米松经圆窗膜渗透入鼓阶后，能在较短的时间内分布到中阶和前庭阶。而且通过圆窗膜渗透给药法相较于内耳开窗法更易于实现，所以是目前内耳局部给药的主要途径。随着药剂学的发展水凝胶和纳米颗粒的载药体系被广泛应用和研究。徐磊等[34]探索可生物降解的壳聚糖-磷酸甘油凝胶系统携带及释放地塞米松进入内耳的特性,及其治疗内耳疾病的可行性。尽管凝胶本身可以在中耳存留较长的时间，但是药物分子可能从凝胶的空隙之间流失，所以利用凝胶的药物缓释方法对内耳的疾病治疗有一定的局限性。而纳米颗粒载药系统[35]可以表现出更高的药物运载能力和特殊的药物积累效应，与凝胶缓释药物相比，基于纳米颗粒载药系统在药物溶解性、药物循环次数和疗效上显示出明显优势。脂质纳米胶囊（lipid nanocapsules LNCS）[36]也同样被应用于内耳药物递送的研究中。研究人员利用此类纳米颗粒包裹咯利普兰作用于体外培养的螺旋神经节细胞和树突细胞，同时，在动物实验中将载药胶囊传递入耳聋豚鼠模型中，观察纳米载体对药物的缓释及对机体的作用。研究证实，脂质纳米胶囊也可以作为一种新型的内耳疾病载药体[37]。

5 讨论

哺乳动物内耳是一类结构和功能复杂的器官，包括耳蜗和前庭两部分，耳蜗对听觉产生起到关键作用。耳蜗内的毛细胞和相连的螺旋神经节细胞是紧密相连又各自分工明确的功能型细胞。听力损伤修复的关键在于重新诱导毛细胞的再生，以及毛细胞和神经细胞建立突触联系。而目前药物治疗、细胞替代疗法和基因治疗等都存在一定的局限性和可行性欠佳。目前，虽然组织工程技术发展如火如荼，然而其在听觉损伤修复与再生的研究和应用才刚刚起步。耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的再生及听觉重建是一项复杂而系统的工程。随着组织工程技术的不断发展和研究的不断深入，通过组织工程技术方法构建仿生柯蒂氏器来模拟内耳微环境和干细胞发育微环境，并结合脱细胞活性ECM关键信号因子的调控作用，进而模拟体内真实环境诱导干细胞向毛细胞和听神经细胞分化，为听力损伤修复提供了一个新的研究思路。如果成功在体外构建出内耳的组织结构，进一步研究探讨是否可以安全有效的移植入机体，并发挥生物学功能这将是听力疾病研究的一大突破。